“鲆優(yōu)1號(hào)”牙鲆和親本群體的表型及遺傳性狀變異分析

田永勝，齊文山，2，姜靜，2，王磊，3，張英平，2，劉萬(wàn)軍，3，陳紅林，2，陳松林*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海，201306；3.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003）

“鲆優(yōu)1號(hào)”牙鲆和親本群體的表型及遺傳性狀變異分析

田永勝1，齊文山1，2，姜靜1，2，王磊1，3，張英平1，2，劉萬(wàn)軍1，3，陳紅林1，2，陳松林1*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海，201306；3.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003）

牙鲆是我國(guó)及大西洋沿岸天然捕撈和養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種，對(duì)其遺傳資源保護(hù)及養(yǎng)殖新品種開(kāi)發(fā)具有重要的意義。本文對(duì)人工培育的牙鲆養(yǎng)殖新品種“鲆優(yōu)1號(hào)”（ZJ）、其父本韓國(guó)牙鲆群體（KS）、母本F0750家系（JX）的18個(gè)表型性狀進(jìn)行測(cè)量，利用SSPS程序進(jìn)行方差分析和多重比較，發(fā)現(xiàn)體長(zhǎng)／體寬，頭長(zhǎng)／眼徑，頭長(zhǎng)／眼間距、眼徑／眼間距，側(cè)線鱗和尾鰭條6個(gè)性狀與父本或母本具有顯著性差異（p＜0.05），可做為鑒別“鲆優(yōu)1號(hào)”的標(biāo)志性表型性狀?！蚌覂?yōu)1號(hào)”與母本無(wú)顯著差異（p＞0.05）性狀占50%。與父本無(wú)顯著性差異（p＞0.05）性狀占33.33%。篩選了24個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星引物對(duì)KS、JX、ZJ和FJ的遺傳多樣性進(jìn)行分析，總共擴(kuò)增出143個(gè)等位基因。4個(gè)群體的平均等位基因數(shù)（Na）大于平均有效等位基因數(shù)（Nae），平均觀測(cè)雜合度大于平均期望雜合度，多態(tài)信息含量（PICa）分析顯示：KS＞JX＞FJ＞ZJ，說(shuō)明人工選育導(dǎo)致了遺傳雜合度的降低。24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在4個(gè)牙鲆群體中的遺傳偏離指數(shù)（D）在－0.759 7到0.188 4之間，在KS、JX、ZJ和FJ群體中分別有10、16、11和17個(gè)位點(diǎn)顯著（p＜0.05）或極顯著（p＜0.01）偏離Hardy-Weinberg平衡。24個(gè)基因位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)（Fst）在0.076 7～0.258 6之間，平均為0.146 8，表明14.68%的變異來(lái)自種群間，85.32%的變異來(lái)自種群內(nèi)。Nei's遺傳距離顯著，KS和FJ遺傳距離最近（0.282 5），遺傳相似系數(shù)最大（0.753 9）；ZJ 與JX遺傳距離最大（0.420 5），遺傳相似系數(shù)最?。?.656 7）。本文研究表明：“鲆優(yōu)1號(hào)”具有明顯的表型和遺傳特征，與父母本及反交群體比較發(fā)生了一定程度的種內(nèi)和種群間遺傳分化，為“鲆優(yōu)1號(hào)”的種質(zhì)鑒別提供了理論依據(jù)。

牙鲆，鲆優(yōu)1號(hào)，表型性狀，衛(wèi)微星標(biāo)記，遺傳多樣性

1 引言

牙鲆Paralichthys olivaceus是我國(guó)主要養(yǎng)殖和捕撈魚(yú)類，年產(chǎn)量達(dá)到26 477.5 t（2009年），排在鲆鰈魚(yú)類產(chǎn)量第二位［1］。但是由于牙鲆苗種養(yǎng)殖成活率低、病害多，極大的限制了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了改善牙鲆的養(yǎng)殖現(xiàn)狀，培育生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)的牙鲆新品種，從21世紀(jì)初開(kāi)始不斷從黃渤海海域收集了當(dāng)?shù)匾吧丽胰后w，利用人工選擇方法篩選出抗鰻弧菌牙鲆群體［2］，并從日本、韓國(guó)引進(jìn)了牙鲆群體，構(gòu)建了牙鲆育種基礎(chǔ)群體。通過(guò)家系建立和篩選、抗病力測(cè)定、后裔鑒定、家系間雜交等方法［3］，于2010年培育出一個(gè)生長(zhǎng)快、成活率高的牙鲆新品種“鲆優(yōu)1號(hào)”［4］。但是對(duì)“鲆優(yōu)1號(hào)”牙鲆的生物學(xué)性狀及分子遺傳性狀的研究至今還未有研究，為了查明“鲆優(yōu)1號(hào)”標(biāo)志性表型特征，以及與其父母本的遺傳區(qū)別，本文對(duì)“鲆優(yōu)1號(hào)”群體、韓國(guó)牙鲆群體、優(yōu)良家系F0750群體及其反交后代群體的表型性狀和微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳性狀進(jìn)行了研究。

表型性狀被大量應(yīng)用于魚(yú)類傳統(tǒng)分類，但近年來(lái)相關(guān)研究報(bào)告極少，在牙鲆形態(tài)性狀研究方面，劉永新和劉金海對(duì)牙鲆家系早期形態(tài)性狀進(jìn)行了分析［5］，在魚(yú)類分類和種質(zhì)鑒別方面，近年來(lái)人們大都傾向于利用分子標(biāo)記對(duì)魚(yú)類種群進(jìn)行鑒定和分析。其中微衛(wèi)星標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位、親子鑒定、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面，趙瑩瑩等利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)6個(gè)虹鱒群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析［6］，全迎春等利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)4個(gè)鯉魚(yú)群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析［7］，Kang等利用180個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和31個(gè)EST分子標(biāo)記構(gòu)建了牙鲆遺傳連鎖圖譜［8］，Song等利用1 624個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了高密度的牙鲆遺傳連鎖圖譜［9］。Fuji等利用微衛(wèi)星標(biāo)記選育出一個(gè)抗淋巴囊腫病的牙鲆新品種［10］?？梢?jiàn)微衛(wèi)星標(biāo)記在魚(yú)類種質(zhì)鑒別、遺傳分析和新品種輔助選育方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，本文試圖將牙鲆育種群體的表型性狀與微衛(wèi)星標(biāo)記性狀結(jié)合起來(lái)，對(duì)牙鲆育種群體進(jìn)行分析，為牙鲆新品種的培育和鑒定探索新的技術(shù)途徑。

2 材料和方法

2.1 樣本來(lái)源

實(shí)驗(yàn)用牙鲆4個(gè)群體樣本均取自山東海陽(yáng)黃海水產(chǎn)有限公司，“鲆優(yōu)1號(hào)”樣本（ZJ）為2010年建立的優(yōu)良家系，其父本為韓國(guó)牙鲆群體（KS），母本為F0750家系群體（JX）；“鲆優(yōu)1號(hào)”具有生長(zhǎng)快、成活率高的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已經(jīng)在山東威海、海陽(yáng)，福建東山等地大面積推廣養(yǎng)殖。韓國(guó)群體（KS）為2008年從韓國(guó)濟(jì)州島收集的牙鲆群體。F0750家系群體（JX）為2007年建立和篩選出的生長(zhǎng)快優(yōu)良家系。鲆優(yōu)1號(hào)反交家系（FJ）是利用KS為母本，F(xiàn)0750為父本建立的全同胞家系。

2.2 牙鲆群體表型性狀測(cè)量和分析

2010年10月對(duì)生長(zhǎng)到2齡的F0750、4齡的韓國(guó)牙鲆及當(dāng)年的“鲆優(yōu)1號(hào)”群體的18個(gè)生物學(xué)性狀進(jìn)行了測(cè)定，生物學(xué)性狀如表2。利用SSPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)獲得的表型性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Student-Newman-Keuls進(jìn)行多重比較和差異顯著性分析，p＜0.05表示具有顯著性差異，p＞0.05表示差異不顯著，表型性狀值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3 4個(gè)牙鲆群體遺傳材料的收集和DNA的提取

以上4個(gè)群體各隨機(jī)選取30個(gè)個(gè)體，剪取鰭條后，分別保存于無(wú)水乙醇中，－20℃下保存?zhèn)溆谩；蚪MDNA提取按常規(guī)酚／氯仿提取方法，將提取的DNA調(diào)整濃度至100 ng／μL備用。

2.4 牙鲆基因組DNA的微衛(wèi)星分析

從牙鲆微衛(wèi)星引物中挑選24條多態(tài)性較高的引物（見(jiàn)表1），由華大基因合成。采用15μL反應(yīng)體系，含1μL模板DNA，上下游引物各0.4μL，其中1.5 μL 10×PCR緩沖液（TIANGEN，含Mg2＋），0.5μL dNTP（CWBIO，2.5 mmol／L），0.1μLTaq DNA聚合酶（TIANGEN，5 U／μL），用滅菌的雙蒸水補(bǔ)充至15 μL。在PCR儀（AB，Alpha－SE）上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，按每對(duì)引物的實(shí)際退火溫度反應(yīng)30～40 s，72℃延伸40 s），72℃延伸10 min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染顯色。

2.5 遺傳數(shù)據(jù)分析與處理

對(duì)照PBR322分子量標(biāo)準(zhǔn)確定每個(gè)個(gè)體的基因型，利用Popgene軟件計(jì)算4個(gè)群體的等位基因數(shù)（No）、有效等位基因數(shù)（Ne）、平均等位基因數(shù)（Na）、平均有效等位基因數(shù)（Nae）、觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He）。同時(shí)計(jì)算了各群體的遺傳相似指數(shù)、遺傳距離、近交系數(shù)（Fis）、遺傳分化指數(shù)（Fst）和基因流（Nm）、香農(nóng)指數(shù)（I）和多態(tài)信息含量（PIC），并進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)（D）的計(jì)算。采取UPGMA方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

3 結(jié)果

3.1 牙鲆不同群體生物學(xué)性狀比較

在測(cè)量的18個(gè)生物學(xué)性狀中“鲆優(yōu)1號(hào)”體長(zhǎng)／體寬顯著大于父母本，頭長(zhǎng)／眼徑顯著小于父母本（p＜0.05），頭長(zhǎng)／眼間距和眼徑／眼間距顯著大于父母本（p＜0.05），側(cè)線鱗和尾鰭條顯著多于父母本（p＜0.05）?？梢詫⑦@幾個(gè)性狀做為鲆優(yōu)1號(hào)的特征性狀（表2）。

“鲆優(yōu)1號(hào)”的體長(zhǎng)／尾柄長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)／尾柄寬、背鰭條3個(gè)性狀與母本F0750無(wú)顯著性差異（p＞ 0.05），但與父本韓國(guó)牙鲆有顯著性差異（p＜0.05）。其他性狀與父母本都無(wú)顯著性差異，“鲆優(yōu)1號(hào)”有9個(gè)性狀與母本無(wú)顯著差異（p＞0.05），占全部性狀的50%?！蚌覂?yōu)1號(hào)”有6個(gè)性狀與父本無(wú)顯著性差異（p＞0.05），占全部性狀的33.33%。說(shuō)明“鲆優(yōu)1號(hào)”與母本的相似性大于父本。

表1 本文中24對(duì)SSR位點(diǎn)信息

表2 鲆優(yōu)1號(hào)（ZJ）與F0750家系（JX）、韓國(guó)牙鲆（KS）群體生物學(xué)性狀比較

續(xù)表2

續(xù)表2

3.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性

試驗(yàn)所用24對(duì)微衛(wèi)星引物均能在的DNA樣品能穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)條帶，引物scaffold773_63332在4個(gè)牙鲆群體中的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。各微衛(wèi)星引物在24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有19個(gè)在4個(gè)牙鲆群體中均顯示出了多態(tài)性（見(jiàn)表3），而位點(diǎn)5和21在ZJ群、位點(diǎn)9 和19在FJ群、位點(diǎn)15在JX群中僅有1個(gè)等位基因，主要原因是由于采集樣本中大部分為全同胞家系個(gè)體造成的。24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在KS群中均表現(xiàn)出多態(tài)性。24對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記總共擴(kuò)增出143個(gè)等位基因，等位基因最多的是位點(diǎn)10和21，有9個(gè)等位基因，而位點(diǎn)19等位基因最少，有2個(gè)等位基因，KS群、JX群、ZJ群和FJ群平均等位基因數(shù)（Na）分別為5.833 3、3.583 3、3.291 7和2.791 7；平均有效等位基因數(shù)（Nae）分別為3.693 0、2.738 3、2.276 4和2.428 9（見(jiàn)表4），所有位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)都不大于觀察到的等位基因數(shù)。

圖1 位點(diǎn)3（scaffold773_63332）在4個(gè)群體中的擴(kuò)增結(jié)果

3.3 牙鲆4個(gè)群體遺傳多樣性

在24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，平均觀測(cè)雜合度在0.189 2～1.000 0之間，平均期望雜合度在0.241 6～0.841 5之間（見(jiàn)表5）。KS、JX、ZJ和FJ群體平均觀測(cè)雜合度分別為3.693 0、2.738 3、2.276 4和2.428 9，平均期望雜合度分別為0.690 4、0.577 3、0.490 0 和0.527 2。4個(gè)群體的Shannon's多樣性指數(shù)Ia分別為3.693 0、1.000 0、0.827 0和0.859 9（見(jiàn)表4）；24個(gè)位點(diǎn)在4個(gè)牙鲆群體中大部分表現(xiàn)為中度或高度多態(tài)，只有位點(diǎn)19在KS群體，2、7、18位點(diǎn)在ZJ群中表現(xiàn)為低度多態(tài)。4個(gè)群體的平均多態(tài)信息含量PICa分別為0.637 0、0.525 9、0.460 1和0.487 9（見(jiàn)表4），4個(gè)群體都屬于高度多態(tài)，但“鲆優(yōu)1號(hào)”多態(tài)性相對(duì)較低。以上數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過(guò)人工選擇后的3個(gè)群體（JX，ZJ和FJ）基因多樣性要遠(yuǎn)低于韓國(guó)群體（KS），且正交和反交群體的基因多樣性要低于父母本群體。

表4 4個(gè)牙鲆群體在24個(gè)微衛(wèi)星基因座上的平均等位基因數(shù)（Na）、平均有效等位基因數(shù)（Nae）、觀測(cè)雜合度（Hao）、期望雜合度（Hae）、Nei氏期望雜合度（Nei）、Shannon's多樣性指數(shù)（Ia）以及多態(tài)信息含量（PICa）

表5 24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在4個(gè)牙鲆群體的觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)（D）、遺傳分化信息（Fis，F(xiàn)st，Nm）

3.4 基因位點(diǎn)遺傳變異

24個(gè)基因位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)（Fst）和基因流（Nm）分析結(jié)果顯示（表5），F(xiàn)st在0.076 7～0.258 6之間，表明群體間遺傳分化在中等水平以上，其中在位點(diǎn)1遺傳分化最低，在位點(diǎn)12和21遺傳分化最高，各位點(diǎn)的平均遺傳分化指數(shù)為0.146 8，表明僅有14.68%的變異由種群間分化導(dǎo)致，而85.32%的變異來(lái)自種群內(nèi)分化。各位點(diǎn)的Nm在0.716 8～3.008 0之間，其數(shù)值越大，表明遺傳分化程度越低，因此，這同樣說(shuō)明位點(diǎn)1在各群體間的遺傳分化程度最低，在位點(diǎn)12和21遺傳分化最高。

3.5 Hardy-Weinberg平衡分析

對(duì)24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分別進(jìn)行等位基因頻率Hardy-Weinberg平衡卡方檢驗(yàn)和遺傳偏離指數(shù)（D）計(jì)算。在KS、JX、ZJ和FJ群體中分別有10、16、11和 17個(gè)位點(diǎn)顯著（p＜0.05）或極顯著（p＜0.01）偏離Hardy-Weinberg平衡，F(xiàn)0750（JX）和反交群體（FJ）偏離位點(diǎn)最多。只有位點(diǎn)2（scaffold912_69534）在各群體中符合Hardy-Weinberg平衡（表6）。24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在4個(gè)牙鲆群體中的遺傳偏離指數(shù)（D）在－0.759 7到0.188 4之間，其中12個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子過(guò)剩（d＞0），其余位點(diǎn)均表現(xiàn)為雜合子缺失（d＜0）（見(jiàn)表5）。

表6 4個(gè)牙鲆群體在24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(yàn)

3.6 牙鲆群體間遺傳距離

各群體間Nei's遺傳距離在0.282 5～0.420 5，平均0.336 7；相似性指數(shù)在0.656 7～0.753 9，平均0.714 8（見(jiàn)表7）。KS群體和FJ群體的遺傳距離最近為0.282 5，遺傳相似系數(shù)最大為0.753 9；ZJ群體與JX群體的遺傳距離最遠(yuǎn)達(dá)到0.420 5，其相似性遺傳指數(shù)最小0.656 7。根據(jù)各群體之間的遺傳距離，采用UPGMA法對(duì)4個(gè)牙鲆群體進(jìn)行聚類（見(jiàn)圖2）。結(jié)果表明KS群體首先和FJ群體聚為一支，它們?cè)倥cJX聚為一支，最后與ZJ聚合。

表7 4個(gè)牙鲆群體間的Nei's遺傳距離（下）及相似性指數(shù)（上）

圖2 牙鲆4個(gè)群體UPGMA聚類圖

4 討論

牙鲆主要分布于渤海、黃海、東海、南海及朝鮮、日本、俄國(guó)遠(yuǎn)東沿岸［11］，是這些國(guó)家主要捕撈和養(yǎng)殖魚(yú)類。分布在我國(guó)海域的牙鲆被認(rèn)為有兩個(gè)生態(tài)種群，北種群（黃渤海群）1－2月份分布于33°30′～37° 30′N和122°30′～124°0′E，南種群（東海群）1－2月份分布于27°～27°30′N和121°30′～122°30′E［12］。在牙鲆雜交品種“鲆優(yōu)1號(hào)”的培育過(guò)程中，最初利用黃海牙鲆種群，日本牙鲆種群，韓國(guó)濟(jì)州島牙鲆種群，以及利用人工感染鰻弧菌后篩選出的抗病牙鲆群體［2—3］。分布于太平洋西岸的牙鲆在分類上屬于同一個(gè)種，但由于地理上的分割，不同的地理群體在外形特征上表現(xiàn)出一定的差異。濟(jì)州島牙鲆群體的體色近似于沙灘色，日本牙鲆群體體背具有較大的白色花瓣?duì)罨y，而黃海牙鲆體背具有白色點(diǎn)狀花紋。形態(tài)上的差異是長(zhǎng)期地理隔離和環(huán)境選擇的結(jié)果。利用不同地理群體進(jìn)行選擇和雜交育種，使不同地理群體的優(yōu)良性狀得到重組，從而培育出符合人們需求的養(yǎng)殖新品種，是魚(yú)類育種主要途徑之一?！蚌覂?yōu)1號(hào)”的培育充分利用了分布在太平洋西岸不同環(huán)境下牙鲆種群的優(yōu)良性狀，經(jīng)過(guò)大量家系建立和篩選，從而培育出一個(gè)具有生長(zhǎng)快、成活率高的牙鲆優(yōu)良養(yǎng)殖品種。經(jīng)過(guò)幾年來(lái)在山東海陽(yáng)、福建東山島等養(yǎng)殖公司的大量推廣養(yǎng)殖，“鲆優(yōu)1號(hào)”體現(xiàn)出生長(zhǎng)快、成活高的優(yōu)良特點(diǎn)，與當(dāng)?shù)仄胀ㄑ丽蚁啾容^，可將苗種養(yǎng)殖生長(zhǎng)速度提高20%以上，成活率提高30%以上［4］，深受養(yǎng)殖用戶的好評(píng)。

表型性狀是判斷一個(gè)物種或品種區(qū)別于其他品種最直觀的特征，在魚(yú)類表型性狀的描述中為了避免不同年齡造成的生長(zhǎng)性狀差異，采用了體長(zhǎng)／體寬、頭長(zhǎng)／眼徑等比例性狀，可有效的減小年齡因素造成的誤差，本文中分析牙鲆4個(gè)群體的表型性狀時(shí)也采用了這一傳統(tǒng)的方法。表型性狀對(duì)于魚(yú)類育種群體的篩選和應(yīng)用可提供直觀的信息，例如對(duì)牙鲆11個(gè)家系后裔不同時(shí)期生長(zhǎng)性狀的分析發(fā)現(xiàn)，全長(zhǎng)貢獻(xiàn)率是形態(tài)性狀中最高的［5］。對(duì)大菱鲆4個(gè)地理群體的生長(zhǎng)性能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)速度上依次為法國(guó)、英國(guó)、丹麥和挪威群體［13］。對(duì)90日齡大菱鲆全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、吻長(zhǎng)、體高、尾柄高、尾柄長(zhǎng)和體質(zhì)量等8項(xiàng)性狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)測(cè)量性狀與體重的相關(guān)系數(shù)達(dá)到極顯著水平［14］，為育種方案的制定提供了一定的依據(jù)。本文對(duì)“鲆優(yōu)1號(hào)”及其父本韓國(guó)牙鲆、母本F0750（日本牙鲆♂×抗病牙鲆♀的雜交后代）的18個(gè)生物學(xué)性狀進(jìn)行測(cè)量和比較分析，由于韓國(guó)牙鲆和F0750都為篩選出的優(yōu)良親本，在育種中相當(dāng)珍貴，在測(cè)量時(shí)只采集了10尾樣本，但經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)其可量性狀和可數(shù)性狀的變動(dòng)已很小，說(shuō)明此樣本量已能較準(zhǔn)確的反映群體的表型性狀。研究發(fā)現(xiàn)“鲆優(yōu)1號(hào)”體長(zhǎng)／體寬，頭長(zhǎng)／眼徑，頭長(zhǎng)／眼間距、眼徑／眼間距，側(cè)線鱗和尾鰭條6個(gè)性狀與父本或母本具有顯著性差異，從此為“鲆優(yōu)1號(hào)”的鑒別找到了標(biāo)志性的表型性狀。

分子標(biāo)記在魚(yú)類種質(zhì)鑒別中的應(yīng)用愈來(lái)愈廣；利用RAPD技術(shù)分析了奧利亞羅非魚(yú)♀×尼羅羅非魚(yú)♂正反雜交子代與親本的遺傳相似系數(shù)，顯示其反交后代與母本極其相似，而其正交群體的性狀介于親本之間［15］。4個(gè)尼羅羅非魚(yú)群體Oreochromis niloticus的種群內(nèi)遺傳相似度為0.745 8～0.815 8［16］。本文利用牙鲆18個(gè)表型性狀通過(guò)多重比較和顯著性分析，發(fā)現(xiàn)“鲆優(yōu)1號(hào)”與母本F0750有50%的性狀無(wú)顯著差異（p＞0.05），與父本有33.33%的性狀無(wú)顯著性差異（p＞0.05），說(shuō)明鲆優(yōu)1號(hào)與母本的相似性大于父本。遺傳距離分析和聚類圖顯示反交群體與父本韓國(guó)牙鲆的遺傳距離最近，其次是母本F0750，而正交群體“鲆優(yōu)1號(hào)”與父本遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，與母本遺傳距離相對(duì)較近，這一點(diǎn)與表型性狀研究結(jié)果具有相似性。利用24個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析顯示“鲆優(yōu)1號(hào)”與母本為遺傳相似性指數(shù)反而小于父本。相反“鲆優(yōu)1號(hào)”親本的反交后代與父本韓國(guó)牙鲆群體的遺傳距離最近，與母本F0750遺傳距離較遠(yuǎn)。是由于分析方法的不同，還是所采用的微衛(wèi)星標(biāo)記與表型性狀相關(guān)性較低造成，有待于進(jìn)一步研究。

利用16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)丹東、北戴河、威海、青島、榮成5個(gè)牙鲆群體進(jìn)行遺傳分析，顯示5個(gè)群體遺傳多樣性差異不顯著，群體間基因分化系數(shù)（GST）為0.099 1，各群體之間存在中度遺傳分化［17］。利用10對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)牙鲆普通群體、感病群體和抗病群體進(jìn)行遺傳分析，顯示2個(gè)選擇性養(yǎng)殖群體遺傳多樣性降低［18］。利用9對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物對(duì)韓國(guó)沿海5個(gè)野生牙鲆群體和3個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，顯示野生群體與養(yǎng)殖群體具有明顯的遺傳分離，東、西和南部的野生群體聚為一支，而養(yǎng)殖群體聚為一支［19］。利用11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)日本沿海周圍的7個(gè)牙鲆群體進(jìn)行分析，7個(gè)群體的遺傳分化系數(shù)相當(dāng)?shù)停‵st＝0.002 5）［20］，可以認(rèn)為是同一個(gè)地理群體。從以上的遺傳分析可以認(rèn)為本文應(yīng)用韓國(guó)牙鲆群體、日本牙鲆群體應(yīng)當(dāng)為代表性群體。而本文中涉及4個(gè)牙鲆群體的遺傳分化系數(shù)為0.076 7～0.258 6，分化系數(shù)相對(duì)較高，主要原因是由于“鲆優(yōu)1號(hào)”父本為韓國(guó)群體，母本F0750的父母本分別為日本群體和從養(yǎng)殖群體中人工篩選而來(lái)的抗病群體，其遺傳背景較為豐富，4個(gè)群體之間產(chǎn)生了中度的遺傳分化，分化水平分別高于日本牙鲆和中國(guó)沿海養(yǎng)殖群體。

觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He）是分析種群內(nèi)遺傳變異的2個(gè)重要指標(biāo)，日本海區(qū)7個(gè)牙鲆種群的平均等位基因No為15.2～18.2，期望雜合度He為0.74～0.78［20］，韓國(guó)沿海牙鲆野生種群平均有效等位基因AR為10.9～16.1，觀測(cè)雜合度Ho為0.820 ～0.888［19］。中國(guó)北部沿海5個(gè)牙鲆養(yǎng)殖群體的觀測(cè)雜合度Ho為0.220 0～0.800 0，期望雜合度He為0.206 1～0.818 7［17］，本文4個(gè)群體的觀測(cè)雜合度Ho為0.538 3～0.619 3，期望雜合度He為0.490 0～0.690 4，本文中牙鲆群體的遺傳多樣性低于日本和韓國(guó)自然群體，但遺傳多樣性高于國(guó)內(nèi)沿海養(yǎng)殖群體，主要原因是由于本文中群體是從以上群體選育而來(lái)，因此遺傳多樣性低于原產(chǎn)地養(yǎng)殖群體，但經(jīng)過(guò)幾代選育，和本地養(yǎng)殖群體相比遺傳多樣性有所提高。

等位基因數(shù)（Na）或有效等位基因數(shù)（Ne）易受到外部環(huán)境（選擇、漂變、遺傳瓶頸等）因素的影響［22］，適合于評(píng)價(jià)群體遺傳變異［23］。本文4個(gè)牙鲆群體的平均有效等位基因數(shù)（Nae）小于平均等位基因數(shù)（Na），其原因主要是由于群體選育及針對(duì)性的家系選育造成的。Locus5、Locus21在ZJ群體中，Locus9 和Locus19在FJ群體中出現(xiàn)了只有1個(gè)等位基因的現(xiàn)象，主要是由于ZJ和FJ群體為一對(duì)父母本交配產(chǎn)生的全同胞家系群體。而韓國(guó)群體為引進(jìn)的養(yǎng)殖群體，因此利用24個(gè)衛(wèi)微星標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，韓國(guó)群體在每個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為多態(tài)性，而在其ZJ和FJ家系群體中出現(xiàn)了單態(tài)現(xiàn)象。

多態(tài)信息含量是衡量位點(diǎn)多樣性的較好指標(biāo)，一般認(rèn)為在某一群體中，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)該位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài)，當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)該位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)，當(dāng)PIC＜0.25時(shí)該位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)［21］。中國(guó)北部沿海牙鲆野生群體的30個(gè)位點(diǎn)多態(tài)信息含量為PIC為0.709～0.892，平均為0.832［23］。本文中4個(gè)牙鲆群體的PICa為0.460 1～0.637 0，平均為0.527 7，相對(duì)于野生群體較低，但都表現(xiàn)為高度多態(tài)，表明這4個(gè)牙鲆群體種群內(nèi)遺傳變異較大，信息含量較高，多態(tài)信息含量從大到小依次為：韓國(guó)牙鲆、F0750、鲆優(yōu)1號(hào)反交群體和鲆優(yōu)1號(hào)。

Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)（d）反映了Ho和He兩者之間的平衡關(guān)系［24］。北部沿海野生牙鲆群體的遺傳偏離指數(shù)d變化范圍從－0.247到0.512［23］，本文中24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在4個(gè)牙鲆群體中的遺傳偏離指數(shù)（D）在－0.759 7到0.188 4之間，其中50%的位點(diǎn)雜合子過(guò)剩（d＞0），其余為雜合子缺失（d＜0）。4個(gè)群體中F0750（JX）和反交群體（FJ）顯著的偏離位點(diǎn)最多，分別達(dá)到16和17個(gè)。主要原因是由于奠基者效應(yīng)（founder effect）和瓶頸效應(yīng)（bottle effect）造成［25］。韓國(guó)牙鲆（KS）是從國(guó)外引進(jìn)，種群數(shù)量有限，選育群體F0750（JX）是一個(gè)生長(zhǎng)快成活率高的家系，父母本為一對(duì)個(gè)體。鲆優(yōu)1號(hào)（ZJ）和其反交群體（FJ）樣本都采自建立的家系群，因而發(fā)生了大部分基因位點(diǎn)的偏離。

綜上所述，人工培育的牙鲆雜交新品種“鲆優(yōu)1號(hào)”與其父母本相比較，在6個(gè)表型性狀上具有顯著性差異；遺傳性狀分析顯示4個(gè)群體之間產(chǎn)生了中度的遺傳分化，而且種群內(nèi)也產(chǎn)生了較大的遺傳變異。說(shuō)明人工培育的“鲆優(yōu)1號(hào)”在表型和遺傳上具有一定的特質(zhì)，這些特點(diǎn)為鑒別“鲆優(yōu)1號(hào)”提供表型和遺傳標(biāo)志，同時(shí)為其優(yōu)良的生產(chǎn)性狀（生長(zhǎng)快、成活率高）提供了一定的遺傳依據(jù)。

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Analysis of phenotype and genetic variation of on“Flounder No.1”Paralichthys Olivaceus and their parental populations

Tian Yongsheng1，Qi Wenshan1，2，Jiang Jing1，2，Wang Lei1，3，Zhang Yingping1，2，Liu Wanjun1，3，Chen Honglin1，2，Chen Songlin1
（1．Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries ResearchInstitute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China；2．College of Fisheries andLife Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；3．School of Marine life Sciences，0cean University of China，Qingdao 266003，China）

Japanese flounder（Paralichthys olivaceus）is one of the most popularspecies for fishing and breeding in China and the Atlantic coast，so it is of great importance for the protection of genetic resources and the development of new species.In present study，18 phenotypic traits of“Flounder No.1”（ZJ），a newly breeding species of Japanese flounder，as well as its male（theKorean Japanese flounder stock，KS）and female parents（F0750 family，JX），were measured.The data were compared by ANOVA and SPSS software.The results showed that there were significant differences（p＜0.05）between“flounder No.1”and its parents regarding 6 traits，e.g.body length／body width，head length／eye diameter，head length／eye spacing，eye diameter／eye spacing，lateral line scales and caudal fin ray which can be used as typical characters for identification of“Flounder No.1”.In“Flounder No.1”，50%of the traits showed no significant differences（p＞0.05）bcompared to its female parent，while the value decreased to 33.3%between“flounder No.1”and its male parent.A total of 24 microsatellite primers were designed to screen the genetic diversity ofKS，JX，ZJand FJ（reciprocal cross offspring），and 143 alleles were identified.For four populations，KS，JX，ZJ and FJ，their mean allelic number（Na）was higher than the effective mean number of alleles（Nae），the mean heterozygosity was higher than the predicted value.The polymorphism information content （PICa）showed thatKS＞JX＞FJ＞ZJ，indicating that the artificial breeding caused the reduction of the genetic heterozygosity.Among the four populations，the genetic deviation index（D）of 24 above mentioned microsatellite loci ranged from－0.759 7 to 0.188 4.And inKS，JX，ZJ and FJ，10，16，11 and 17 loci were significantly（p＜0.05）or extremely（p＜0.01）deviated from Hardy-Weinberg equilibrium，respectively.The genetic-differentiation-index（Fst）of 24 loci ranged from 0.076 7 to 0.258 6，with the mean value 0.1468，which suggests that 14.68%of the variations result from the interspecies，while 85.32%are intraspecific variations.Furthermore，there was significant difference for Nei's genetic distance among four populations.The nearest genetic distance occured betweenKS and FJ（0.282 5），togehter with the highest genetic similarity coefficient（0.753 9）.While the furthest（0.420 5）one was found between ZJ and JX with the lowest（0.656 7）genetic similarity coefficient.In this study，the observation indicated：“flounder No.1”has the obvious phenotypic and genetic characteristics，shows a certain degree of genetic differentiation in intraspecies and interspecies in comparison to its parents and reciprocal cross offspring，which provides the theoretical basis for the germplasm identification of“Flounder No.1”.

Paralichthys Olivaceus；“Flounder No.1”；phenotypic traits；microsatellite markers；genetic diversity

Q959.486

A

0253-4193（2014）06-0075-12

2013-04-18；

2014-02-17。

“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2012AA10A408）；山東省泰山學(xué)者建設(shè)工程專項(xiàng)資助。

田永勝（1964－），男，甘肅省會(huì)寧縣人，研究員，博士，主要從事魚(yú)類低溫生物學(xué)及遺傳育種研究。E-mail：tianys＠ysfri.ac.cn

*通信作者：陳松林（1960－），男，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)生物技術(shù)研究。E-mail：chensl＠ysfri.ac.cn

田永勝，齊文山，姜靜，等.“鲆優(yōu)1號(hào)”牙鲆和親本群體的表型及遺傳性狀變異分析［J］.海洋學(xué)報(bào)，2014，36（6）：75—86，

10.3969／j.issn.0253-4193.2014.06.010

Tian Yongsheng，Qi Wenshan，Jiang Jing，et al.Analysis of phenotype and genetic variation of on“Flounder No.1”Paralichthys Olivaceus and their parental populations［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（6）：75—86，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.06.010