厄貝沙坦對高血壓合并糖尿病大鼠脂肪肝的治療作用及機制探討

鐘娟，陳靜，雷任國，黎洪棉，覃亞勤△

厄貝沙坦（Irbesartan，IRB）為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB），在臨床上主要用于降血壓治療，并可能通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)起到肝臟保護作用。近年來大量的臨床和實驗研究證實，IRB還具有調(diào)節(jié)糖、脂代謝紊亂，降低尿蛋白以及保護心、腎等靶器官的作用，可用于非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）、代謝綜合征、動脈粥樣硬化等疾病的治療［1-2］。筆者前期采用先天瘦素受體基因缺陷導致NAFLD的db/db小鼠模型［3］和脂質(zhì)混合物誘導LO2細胞脂肪變的細胞模型［4］，觀察厄貝沙坦治療脂肪肝的療效及其機制，結(jié)果顯示，厄貝沙坦可能通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）的表達，進而激活磷酸腺苷依賴的蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，誘導肝細胞自噬，減輕db/db小鼠肝臟和脂質(zhì)混合物誘導的LO2細胞脂肪變。但由于前期動物實驗中未加用PPAR-γ抑制劑進行干預，以上作用機制還需進一步驗證。隨著現(xiàn)代生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，臨床上NAFLD多與高血壓、糖尿病并存，三者相互影響，顯著增加心腦血管疾病的發(fā)生率和病死率［5］。因此，本研究通過建立高血壓合并糖尿?。⊿HDM）動物模型，并加用PPAR-γ抑制劑聯(lián)合干預，觀察厄貝沙坦對SHDM大鼠脂肪肝的治療作用并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性4周齡原發(fā)性高血壓模型大鼠24只，同齡SPF級健康雄性Wistar大鼠6只，均購自北京維通利華實驗動物有限公司［合格證號：SCXK（京）2018-0007］，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學SPF級實驗動物中心層流架內(nèi)，溫度22～25℃、濕度40%～70%，自由攝食飲水。實驗操作遵循《南方醫(yī)科大學實驗動物倫理和使用指南》。

1.2 藥物、試劑和儀器 厄貝沙坦片（150 mg/片，國藥準字J20080061，生產(chǎn)批號5A173）購自杭州賽諾菲制藥有限公司；PPAR-γ抑制劑（T0070907）購自美國Selleck Chemicals公司；兔源一抗PPAR-γ、AMPK，磷酸化AMPK（p-AMPK）、mTOR、磷酸化mTOR（p-mTOR）、微管相關蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B）購自美國CST公司；鼠源一抗β-actin、HRP標記的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗以及ECL顯影液均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；Mini-Protein電泳槽購自Bio-Rad；Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)購自美國KODAK公司；日立7180全自動生化儀購自深圳市永利鑫科技有限公司；JEM1010型透射電鏡購自北京普瑞賽司儀器有限公司；光學顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 SHDM大鼠動物模型建立 原發(fā)性高血壓模型大鼠予高糖高脂飼料（蔗糖20%、脂肪18.5%、膽固醇1%、丙硫氧嘧啶0.2%、基礎飼料60.3%）喂養(yǎng)1個月后，使用鏈脲佐菌素35 mg/kg一次性腹腔注射并繼續(xù)配合高糖高脂飼料喂養(yǎng)，2周后，尾靜脈取血檢測大鼠隨機血糖＞16.7 mmol/L，成功建立SHDM大鼠模型。根據(jù)肝臟病理檢查確定SHDM大鼠合并脂肪肝。造模成功率100%，但造模過程中死亡率為12%。

1.3.2 動物分組與藥物干預 按隨機數(shù)字表法將SHDM大鼠分為模型組、厄貝沙坦組、厄貝沙坦+PPAR-γ抑制劑組；另選取Wistar大鼠作為正常對照組，每組6只。厄貝沙坦組按厄貝沙坦50 mg/（kg·d）灌服，厄貝沙坦+PPAR-γ抑制劑組給予厄貝沙坦灌服（同厄貝沙坦組）和T0070907按1.5 mg/（kg·d）腹腔注射治療，模型組和正常對照組灌服與厄貝沙坦組等量生理鹽水，1次/d，共給藥8周。

1.3.3 血壓、血糖、血脂及肝功能檢測 末次給藥結(jié)束后，采用無創(chuàng)動物血壓儀測量各組大鼠尾動脈收縮壓（SBP），測量3次取平均值。禁食12 h，予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，采用生化儀檢測血糖（Glu）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）。

1.3.4 肝臟病理檢查 各組肝組織標本經(jīng)4%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。每組取6張切片，應用NAFLD活動性評分（NAFLD activity score，NAS）半定量評定肝臟脂肪變程度［6］：脂肪變＜5%為0分；5%≤脂肪變＜33%為1分；33%≤脂肪變＜66%為2分；脂肪變≥66%為3分；此外，根據(jù)小葉內(nèi)炎癥（無為0分，1個病灶為1分，2～4個病灶為2分，＞4個病灶為3分）和肝細胞氣球樣變程度（無為0分，少數(shù)1分，多數(shù)2分）累計加分，NAS積分在0～8分。

1.3.5 免疫組化檢測肝組織PPAR-γ的表達 各組肝組織標本經(jīng)4%甲醛固定，乙醇梯度脫水，然后浸蠟和包埋，切取2μm石蠟切片?，F(xiàn)配3%H2O2孵育20 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。蒸餾水沖洗3次后，取PPAR-γ一抗工作液（1∶50），濕盒中4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，滴加二抗、室溫孵育30 min，PBS漂洗3次。配制DAB顯色劑、孵育約10 min，蘇木素復染5 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察。每組取6張切片標本，采用Image-Pro Plus 6.0（IPP）軟件對目的蛋白的陽性著色進行半定量分析。

1.3.6 Western blot檢測肝組織PPAR-γ、AMPK/mTOR信號通路及自噬標志蛋白LC3B的表達 提取各組肝組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取20μg蛋白上樣，采用12%或15%分離膠，5%濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗PPAR-γ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、LC3B、β-actin，按照1︰1 000稀釋，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗（1︰2 000），室溫孵育1 h，ECL法檢測。運用Image Station 2000R圖像工作站取像，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白的灰度值作為蛋白的相對表達量進行條帶灰度分析。

1.3.7 電鏡下觀察自噬小體 取約1 mm3大小肝組織塊，先置于2.5%冷戊二醛溶液在4℃預固定1周，后用1%四氧化鋨作后固定24 h。依次丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片，將超薄切片裱在小銅網(wǎng)上，經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色后電鏡下觀察，并記錄隨機視野內(nèi)自噬小體個數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 厄貝沙坦對SHDM大鼠血壓、血糖、血脂及肝功能的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠SBP、Glu、TC、TG、AST和ALT均顯著升高（P＜0.05）；經(jīng)厄貝沙坦治療后，SHDM大鼠以上指標均有降低，但仍高于正常對照組（P＜0.05）。厄貝沙坦聯(lián)合PPAR-γ抑制劑干預后，SBP、TC、TG、AST和ALT又再次升高（P＜0.05），見表1。

2.2 厄貝沙坦對SHDM大鼠肝臟病理的影響 經(jīng)HE染色后，正常對照組于光鏡下可見肝細胞排列整齊，而模型組出現(xiàn)空泡性變、細胞脫落等典型肝細胞脂肪性變，模型組NAS定量評分（6.50±1.52）顯著高于正常對照組（0.50±0.55）。經(jīng)厄貝沙坦干預后，SHDM大鼠肝臟脂肪性變明顯減輕，NAS定量評分（3.83±1.47）較模型組降低（P＜0.05）。但厄貝沙坦聯(lián)合PPAR-γ抑制劑干預后，HE染色顯示SHDM大鼠肝細胞脂肪性變加重，NAS定量評分（5.67±1.75）較厄貝沙坦組升高（n=6，F(xiàn)=21.695，P＜0.05），見圖1。

2.3 免疫組化檢測厄貝沙坦對肝組織PPAR-γ表達的影響 模型組大鼠肝組織PPAR-γ表達量的平均光密度值為0.09±0.03，與正常對照組（0.48±0.08）相比明顯減少（P＜0.05），而經(jīng)厄貝沙坦治療后，SHDM大鼠肝組織PPAR-γ表達（0.34±0.08）較模型組顯著增多（P＜0.05）。但加用PPAR-γ抑制劑干預后，SHDM大鼠肝組織PPAR-γ的表達（0.18±0.05）再次減少（n=6，F(xiàn)=45.905，P＜0.01），見圖2。

Tab.1 The effect of irbesartan on blood pressure,blood glucose,serum lipid and liver function in SHDMrats表1 厄貝沙坦對SHDM大鼠血壓、血糖、血脂及肝功能的影響 （n=6，x±s）

Fig.1 HE staining of hepatic tissues in the four groups of rats(×200)圖1 各組大鼠肝組織HE染色情況（×200）

Fig.2 Immunohistochemical staining of PPAR-γin hepatic tissues of rats(×200)圖2 免疫組化檢測各組大鼠肝組織PPAR-γ的表達（×200）

2.4 厄貝沙坦對PPAR-γ介導AMPK/mTOR信號通路及自噬標志蛋白LC3B表達的影響 Western blot檢測顯示，厄貝沙坦顯著增加SHDM大鼠肝組織PPAR-γ表達和AMPK磷酸化水平，降低mTOR磷酸化水平（P＜0.05）；但聯(lián)合PPAR-γ抑制劑干預后，PPAR-γ表達和AMPK磷酸化水平降低，mTOR磷酸化水平升高（P＜0.05）。并且，厄貝沙坦可升高SHDM大鼠肝組織LC3BⅡ/Ⅰ比值（P＜0.05），見圖3。

2.5 各組大鼠肝臟自噬小體的表達 SHDM大鼠肝細胞自噬小體數(shù)量（個/視野：0.83±0.75）較正常對照組（2.83±1.17）減少。經(jīng)厄貝沙坦干預后，SHDM大鼠肝細胞自噬小體數(shù)量（4.00±1.41）較模型組顯著增多（P＜0.05）。但加用PPAR-γ抑制劑干預后，SHDM大鼠肝細胞自噬小體數(shù)量（2.00±1.26）再次減少（n=6，F(xiàn)=7.751，P＜0.05），見圖4。

Fig.3 Effects of irbesartan on PPAR-γ-mediated AMPK/mTOR signaling pathway and protein expression of LC3B圖3 厄貝沙坦對PPAR-γ介導AMPK/mTOR信號通路及自噬標志蛋白LC3B表達的影響

Fig.4 Autophagosomes formation in hepatocytes detected by transmission electron microscopy圖4 透射電鏡檢測各組大鼠肝臟自噬小體的形成

3 討論

3.1 厄貝沙坦對脂肪肝的治療作用 脂肪肝既是一個獨立的疾病，又可見于全身性疾患在肝臟的一種病理過程，分為酒精性脂肪性肝?。ˋFLD）和NAFLD兩大類。當前NAFLD的發(fā)病率顯著增高，國內(nèi)50%的高血壓患者有NAFLD［7］。NAFLD可增加高血壓發(fā)病風險，直接影響糖尿病治療的療效和預后，且糖尿病患者胰島素抵抗導致體內(nèi)游離脂肪酸增高，由此產(chǎn)生的“脂毒性”進一步損傷胰島β細胞和血管內(nèi)皮細胞功能，加重2型糖尿病和高血壓，由此形成惡性循環(huán)。本研究在SHDM大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，大鼠除血壓、血糖升高外，血清中TC、TG、AST和ALT水平均明顯增高，且肝組織病理出現(xiàn)典型脂肪性變，NAS評分顯著升高，表明SHDM大鼠同時存在脂肪肝改變。厄貝沙坦干預后發(fā)現(xiàn)SHDM大鼠SBP、Glu、TC、TG、AST和ALT均有降低，病理檢查顯示肝臟脂肪性變改善明顯。結(jié)果表明，厄貝沙坦不僅可降低SHDM大鼠血壓、血糖，而且可治療其脂肪肝。

3.2 厄貝沙坦可上調(diào)PPAR-γ的表達 厄貝沙坦為獨特的ARB類降壓藥，其具有PPAR-γ激動功能［8］。PPAR-γ為核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，是脂肪細胞基因表達和胰島素細胞間信號傳遞的主要調(diào)節(jié)者，參與調(diào)控糖和脂肪代謝、能量平衡，降低血脂和血壓，改善胰島素抵抗，抑制炎癥反應，拮抗氧化應激等［9］。而且，PPAR-γ還可激活AMPK介導的信號通路，從而調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporter，GLUT）表達以及糖脂代謝相關激酶（如葡萄糖激酶、脂聯(lián)素等）的活性，進而促進脂肪酸氧化、增加葡萄糖攝取、抑制肝葡萄糖輸出、減少脂質(zhì)及膽固醇合成等。Zhong等［6，10］研究顯示，PPAR-γ激動劑厄貝沙坦通過上調(diào)PPAR-γ的表達，降低固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP1）水平以及激活AMPK/Akt/mTOR信號通路，改善2型糖尿病ob/ob小鼠和db/db小鼠脂肪肝，減輕肝損害。本研究發(fā)現(xiàn)，SHDM大鼠肝組織PPAR-γ表達明顯減少，而經(jīng)厄貝沙坦干預后，大鼠肝組織PPAR-γ表達顯著增加，表明厄貝沙坦可上調(diào)PPAR-γ的表達，從而進一步調(diào)節(jié)糖、脂代謝紊亂，治療脂肪肝。

3.3 厄貝沙坦激活PPAR-γ介導AMPK/mTOR信號通路，誘導肝細胞自噬 AMPK是細胞感受能量狀態(tài)變化調(diào)節(jié)的一種重要的蛋白激酶，當細胞內(nèi)腺苷三磷酸（ATP）生成減少時，磷酸化激活的AMPK可以通過抑制mTOR磷酸化來抑制細胞生長，誘導自噬，促進分解代謝。自噬除降解肝細胞內(nèi)過多或損傷的細胞器和蛋白質(zhì)外，還介導肝細胞內(nèi)脂肪的代謝和分解，促進脂滴內(nèi)貯存脂質(zhì)的降解［11-12］。Kim等［13］研究顯示，在肥胖患者和脂肪肝大鼠中，肝臟內(nèi)自噬抑制物被激活，肝臟自噬總量減少。本研究發(fā)現(xiàn)SHDM大鼠的肝組織中AMPK磷酸化水平明顯降低，mTOR磷酸化水平水平明顯升高，LC3BⅡ/Ⅰ比值和自噬小體數(shù)量下降，提示SHDM大鼠肝組織中AMPK/mTOR信號通路受抑制，肝臟自噬減少。給予厄貝沙坦后，SHDM大鼠肝組織AMPK磷酸化水平增加，mTOR磷酸化水平降低，LC3BⅡ/Ⅰ比值和肝細胞自噬小體數(shù)量均升高，但加用PPAR-γ抑制劑后，以上效應被逆轉(zhuǎn)，表明厄貝沙坦可上調(diào)PPAR-γ的表達，進而誘導AMPK/mTOR信號通路的活化，提示其可通過激活PPAR-γ介導的AMPK/mTOR信號通路，促進肝細胞自噬，減輕肝臟脂質(zhì)沉積，從而起到治療脂肪肝的作用。