在中醫(yī)院校研究生中開設(shè)“激光掃描共聚焦顯微術(shù)”的探索

尹素改 張穎 陳玉龍

【摘要】激光掃描共聚焦顯微術(shù)是目前最先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)之一，隨著激光掃描共聚焦顯微鏡性能的不斷提高，該技術(shù)在生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，并逐漸成為生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的必不可少的研究手段。醫(yī)學(xué)院校研究生作為集自然科學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)科學(xué)和實(shí)驗(yàn)技能為一身的高級專門人才，必須了解和掌握這一科研技術(shù)。

【關(guān)鍵詞】激光掃描共聚焦顯微術(shù)醫(yī)學(xué)院校探索

【課題項(xiàng)目】河南中醫(yī)學(xué)院苗圃工程項(xiàng)目：MP2012-02；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持項(xiàng)目, 項(xiàng)目編號為：NCET-11-0946。

【中圖分類號】G64 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-3089（2014）07-0249-01 激光掃描共聚焦顯微術(shù) (Laser scanning confocal microscope，LSCM)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù)[1]，是在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上，結(jié)合激光、電子攝像和計(jì)算機(jī)圖像處理等現(xiàn)代高科技手段而形成的先進(jìn)的細(xì)胞分子生物學(xué)分析技術(shù)。因其獨(dú)特的激光掃描裝置具有不損傷細(xì)胞、分辨率高、實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒夤捕ㄎ磺夷苡^察樣品的三維圖像等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)和環(huán)境科學(xué)以及抗腫瘤藥物研究等領(lǐng)域[2]。在三年的教學(xué)實(shí)踐中，我們得到了以下幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn):

一、教材編寫

激光掃描共聚焦顯微術(shù)作為一門實(shí)驗(yàn)技術(shù)，必須以理論為基礎(chǔ)。但激光掃描共聚焦顯微術(shù)應(yīng)用過于廣泛，開設(shè)的課時有限，加上目前沒有非常權(quán)威和經(jīng)典的教材，所以要針對學(xué)生的情況和專業(yè)來精選授課內(nèi)容，編寫教材，讓學(xué)生既能看懂，又能學(xué)以致用。

二、課前準(zhǔn)備

首先，教師在上課前應(yīng)做好充分準(zhǔn)備。教師強(qiáng)烈的責(zé)任感和事業(yè)心及熟練的實(shí)驗(yàn)技能，對學(xué)生起著潛移默化的作用。教師要做好課件，充分利用多媒體，在平時實(shí)驗(yàn)時可以進(jìn)行DV 拍攝，然后在課堂上觀看，結(jié)合理論知識進(jìn)行總結(jié)、分析。要求學(xué)生課前預(yù)習(xí)，讓學(xué)生明確目的、要求及所需物品、器材等，“知其然，知其所以然”，這樣才能提高學(xué)生的實(shí)踐能力。另外，讓學(xué)生參與課前準(zhǔn)備工作，可以在督促同學(xué)做好課前預(yù)習(xí)的同時，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)的實(shí)驗(yàn)態(tài)度，增強(qiáng)其動手能力。

三、教學(xué)過程

1.加強(qiáng)“激光掃描共聚焦顯微術(shù)”基礎(chǔ)理論的講解：激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共聚焦原理和裝置，并利用計(jì)算機(jī)對所觀察的對象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統(tǒng)，相對比較復(fù)雜，單純的講述難以達(dá)到教學(xué)目的。在教學(xué)實(shí)踐中，儀器原理及應(yīng)用介紹要緊密結(jié)合，對照儀器，現(xiàn)場講述，從原理到應(yīng)用，從基礎(chǔ)研究到臨床研究，以學(xué)生熟悉的實(shí)驗(yàn)為例子，既豐富了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，又加深了學(xué)生的理解，使理論介紹更加通俗易懂。

2.完善教師示教內(nèi)容：教師不但要講樣品制作的一般流程和上機(jī)檢測的步驟，對于上機(jī)前樣品處理過程和一些需要注意的細(xì)節(jié)也要邊示范邊講解。例如用PI/annexin V-FITC法檢測貼壁細(xì)胞凋亡[3]，實(shí)際操作時，采用PI和Annexin V 分開染，即，PI先染，離心去掉染液后，再加結(jié)合液和Annexin V，10min 后上機(jī)檢測；而試劑盒說明書上是PI和Annexin V同時染。經(jīng)過試驗(yàn)比較，我們發(fā)現(xiàn)分開染可以減少實(shí)驗(yàn)誤差，因?yàn)镻I本身對細(xì)胞也是有毒性的。通過這樣的細(xì)節(jié)告訴學(xué)生: 實(shí)驗(yàn)是一個非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)操過程，需要勤動手，愛動腦，任何一個小的細(xì)節(jié)都會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

同時一些操作細(xì)節(jié)也要告訴學(xué)生，比如：為控制其他因素對觀察結(jié)果的影響，不同樣品的片子之間保持激光電壓在掃描時相對穩(wěn)定，激光電壓和增益一致以及掃描頭接收光波波譜范圍一致的前提下，掃描細(xì)胞多個斷層后得到的擴(kuò)展焦點(diǎn)圖作為最終的圖形結(jié)果；為了減少因熒光淬滅或漂白帶來的影響，在成像之前接受可見光和激光照射的時間盡可能短而且相等；在實(shí)驗(yàn)中所用的載玻片和蓋玻片盡可能薄，玻面光潔，厚度均勻，使用前應(yīng)清潔液、乙醇液、蒸餾水泡洗，以消除雜質(zhì)熒光；蓋玻片覆蓋標(biāo)本后立即用無標(biāo)本腐蝕作用的緩沖甘油封片，甘油要求沒有自發(fā)熒光。

3.在實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)學(xué)生的科研精神：從檢測目的到熒光染料選擇、從數(shù)據(jù)獲取到結(jié)果分析，引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)步驟的設(shè)計(jì)。適當(dāng)增加流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用中的一些新技術(shù)新方法，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性和對科研的興趣。如細(xì)胞凋亡檢測，可以將學(xué)生分成兩組，第一組用PI/annexin V-FITC法，第二組用線粒體跨膜電位變化的檢測法。這兩種方法都能檢測細(xì)胞的早期凋亡，但效果是不同的。

4.及時小結(jié)，不斷提高: 實(shí)驗(yàn)完成后，要求學(xué)生用理論知識解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后教師歸納總結(jié)，分析各組實(shí)驗(yàn)過程中的經(jīng)驗(yàn)和不足，進(jìn)一步鞏固激光掃描共聚焦顯微術(shù)的相關(guān)知識，加強(qiáng)記憶。這樣，使學(xué)生在取得豐富的感性認(rèn)識的基礎(chǔ)上，透過現(xiàn)象看本質(zhì)，從而將感性認(rèn)識上升到理性認(rèn)識。

在中醫(yī)藥領(lǐng)域中，激光掃描共聚焦術(shù)的應(yīng)用日益廣泛 。所以我們在研究生中開設(shè)的這樣的課程，這是一個新的嘗試，學(xué)生反饋情況良好。在以后的教學(xué)中，我們將繼續(xù)探索好的教學(xué)方法，進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平，促使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中學(xué)會思考、主動分析、研究問題，更好地掌握專業(yè)知識和技術(shù)，為今后的職業(yè)發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] White J.G. et al. Confocal microscopy comes of age [J]. Nature(London), 1987,328: 183-184.

[2] Brakenhoff G.T.et al.Three dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy[J]. Micros,1989,153(2): 151-159.

[3] 王書奎，周振英．實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)彩色圖譜[M].上海: 第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2004: 95-326．

[4] 代志軍，王西京，薛茜等．半枝蓮含藥血清對肝癌H22細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào), 2008,6 ( 8 ) : 821-826.