HPLC法測(cè)定白蠟樹葉中秦皮甲素含量

孫亞偉　 孫豐潤(rùn)

摘要 [目的]測(cè)定白蠟樹葉中秦皮甲素的含量。[方法]樣品經(jīng)無水甲醇回流提取，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-濃度0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 ml/min，采用高效液相色譜法測(cè)定含量。[結(jié)果]平均回收率為96.59%，RSD為2.39%（n=6）；白蠟樹葉中秦皮甲素的平均含量為0.155 9 mg/g。[結(jié)論]該方法穩(wěn)定性好，精密度高，重現(xiàn)性好，可用于白蠟樹葉中秦皮甲素的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 秦皮甲素；白蠟樹葉；HPLC；含量測(cè)定

中圖分類號(hào) O657.7；S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02327-03

木犀科植物白蠟樹（Fraxinus chinensis Roxb.）在我國(guó)分布廣泛。其枝皮作為中藥秦皮入藥，一般采用取枝剝皮或刨樹剝皮的辦法獲取。秦皮具有清熱燥濕、收澀止痢、止帶和明目的功效，主要用于治療濕熱瀉痢、赤白帶下、目赤腫痛和目生翳膜等癥。秦皮中的主要活性成分是秦皮甲素（Aesculin）和秦皮乙素（aesculetin）。多種治療腸炎、單純皰疹病毒性角膜炎的中成藥均以秦皮甲素含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)。秦皮甲素還對(duì)試驗(yàn)性脂肪肝有一定的防治作用[1]；可抑制人肺癌細(xì)胞H125體外增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。每年秋季有大量的白蠟樹葉脫落而得不到利用，為了從自然界獲取更多的藥用資源，又不破壞植被，筆者對(duì)白蠟樹葉中的秦皮甲素含量進(jìn)行測(cè)定，以期為白蠟樹葉的合理開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。白蠟樹葉，于8月中旬采自山東濱州市城區(qū)，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院孫豐潤(rùn)教授鑒定為白蠟樹（Fraxinus chinensis Roxb.）的樹葉。

1.1.2 主要儀器。Agilent 1260 HPLC儀（DAD檢測(cè)器和Agilent 1260工作站），購(gòu)自Agilent公司；AE240電子分析天平，購(gòu)自瑞士METTLER公司；CQ250超聲波清洗器，購(gòu)自上海超聲波儀器廠；玻璃儀器用超聲波清洗器清洗1 h，用超純水洗凈后烘干備用。

1.1.3 主要試劑。秦皮甲素，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：748701；秦皮乙素，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110741200506；乙腈為色譜純，購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；甲醇為色譜純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硅膠G薄層板，購(gòu)自青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司；三氯甲烷、甲酸和乙酸乙酯均為分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 薄層層析。

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備。分別取適量秦皮甲素對(duì)照品、秦皮乙素對(duì)照品，加無水甲醇制成每1.0 ml各含2.0 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備。取1.000 g干燥的白蠟樹葉粉末，加乙酸乙酯10 ml，浸泡1 h，超聲15 min，濾過，濾液揮干，加5 ml無水甲醇溶解，過濾，取濾液作為供試品溶液。

1.2.1.3 薄層層析。吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-無水甲醇-甲酸（6∶1∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.2.2 含量測(cè)定。

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備。精密稱定2.50 mg秦皮甲素，3.91 mg秦皮乙素，以無水甲醇溶解，并分別定容至50 ml的容量瓶中，備用。

1.2.2.2 樣品溶液的制備。精密稱取1.590 g干燥的白蠟樹葉粉末（過3號(hào)篩），置具塞錐形瓶中，精密加入50 ml無水甲醇，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用無水甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.3 色譜分析條件。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-濃度0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl。

1.2.2.4 方法學(xué)考察。（1）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。（2）線性關(guān)系的考察。分別精密吸取秦皮甲素對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml分別置10 ml量瓶中，用無水甲醇稀釋至刻度，搖勻；分別精密吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量X（mg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取0.01 mg/ml濃度的對(duì)照品溶液各10 μl，分別于1、2、4和6 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算峰面積積分值的RSD。（4）精密度試驗(yàn)。精密吸取0.01 mg/ml濃度的對(duì)照品溶液各10 μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積的RSD值（5）重現(xiàn)性試驗(yàn)。按樣品溶液制備方法平行制備樣品溶液5份，每份取10 μl，按“樣品測(cè)定”方法測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。（6）加樣回收試驗(yàn)。取已知秦皮甲素含量的白蠟樹葉，按“樣品溶液制備”方法制備樣品溶液，在無水甲醇補(bǔ)足減失的重量前，精密添加對(duì)照品溶液2.0 ml，混勻，精密吸取上述溶液10 μl進(jìn)樣，測(cè)定回收率（n=6），計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.2.5 樣品的含量測(cè)定。取適量供試品溶液，按照“線性關(guān)系”方法，對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算白蠟樹葉中秦皮甲素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層分析 圖1表明，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。白蠟樹葉在秦皮乙素相應(yīng)的位置上斑點(diǎn)不明顯；以同樣方法對(duì)白蠟樹翅果進(jìn)行試驗(yàn)，未檢出秦皮甲素、秦皮乙素斑點(diǎn)。

2.2 方法學(xué)考察 （1）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖2表明，供試品溶液和對(duì)照品溶液在此條件下分離效果良好。而樣品溶液中秦皮乙素含量極低，因此不再進(jìn)行含量測(cè)定。（2）線性關(guān)系的考察。計(jì)算得線性回歸方程為：Y=1 627.50X+142.89，R為0.998 0。試驗(yàn)結(jié)果表明，在0.025 0～0.250 0

素濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。計(jì)算得峰面積積分值的RSD為1.06%，表明指標(biāo)成分在6 h內(nèi)比較穩(wěn)定。（4）精密度試驗(yàn)。計(jì)算得峰面積的RSD為1.15%，說明條件精密度良好。（5）重現(xiàn)性試驗(yàn)。計(jì)算得峰面積的RSD為1.23%，表明方法重現(xiàn)性良好。（6）加樣回收試驗(yàn)。由表1可知，平均回收率為96.59%，RSD為2.39%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確，可靠，可用于白蠟樹葉中秦皮甲素的含量測(cè)定。

2.3 樣品的含量測(cè)定 由表2可知，白蠟樹葉中秦皮甲素

3 結(jié)論與討論

最新版中國(guó)藥典規(guī)定，秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的總量，不得少于1.0%[3]。而白蠟樹葉中秦皮甲素含量只有0.016%，秦皮乙素含量更低，因此，白蠟樹葉不可作為秦皮代用品。隨著天然藥物提取技術(shù)進(jìn)步，提取成本降低，白蠟樹葉可作為工業(yè)原料用于秦皮甲素的提取。

木犀科植物中與白蠟樹近緣植物的根、樹皮中秦皮甲素和秦皮乙素定性、定量測(cè)定已有諸多報(bào)道，其中左月明等報(bào)道了苦櫪白蠟樹（Fraxinus rhynchophylla Hance）、宿柱白蠟樹（Fraxinus stylosa Lingelsh）葉中秦皮甲素的含量[4]，而關(guān)于白蠟樹（Fraxinus chinensis Roxb.）葉中秦皮甲素定性、定量測(cè)定的研究鮮有報(bào)道。試驗(yàn)參照最新版中國(guó)藥典方法測(cè)定，方法科學(xué)、簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，實(shí)用性強(qiáng)。

秦皮甲素和秦皮乙素為香豆素類化合物，在自然界中分布廣，生物活性明確，試驗(yàn)只是初報(bào)，其在白蠟樹不同部位、不同采集時(shí)間與含量的變化規(guī)律還要進(jìn)一步探討。魯北地區(qū)多鹽堿地，可供種植的植物種類少，而白蠟樹在魯北地區(qū)長(zhǎng)勢(shì)良好，在不破壞植被的情況下，充分利用落葉資源，又可以保持環(huán)境衛(wèi)生，有利于區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

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李小華，孫毅毅.秦皮甲素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝的防治作用[J].中國(guó)新藥與臨床雜志，2010，29（9）：679-683.

[2] 王晶. 秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞H125體外增殖的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（2）：507-509.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010：254.

[4] 左月明，王振月，崔紅花，等. 不同地理種源秦皮的樹皮及葉中秦皮甲素、秦皮乙素的含量測(cè)定[J].中成藥，2003，25（7）：36-38.