豬瘟母源抗體衰減及保護(hù)水平分析

范學(xué)政，徐 璐，寧宜寶，王 琴，趙啟祖，鄒興啟，朱元源，王 芳，丁家波

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是豬的一種高度傳染病，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。我國的豬瘟兔化弱毒疫苗免疫原性好，效果確實(shí)，在控制豬瘟流行起了重要作用，但因缺乏簡便有效的免疫監(jiān)測(cè)手段，往往使制定免疫程序缺少依據(jù)。母源抗體是母乳中的免疫活性物質(zhì)，在初免時(shí)，如果仔豬體內(nèi)母源抗體水平較高而施行疫苗免疫，常導(dǎo)致免疫效果不理想。但是，如果母源抗體完全消失后再免疫，雖然免疫效果好，卻存在一定的感染風(fēng)險(xiǎn)。母源抗體的半衰期為14 d左右，豬場(chǎng)一般將首免確定在20日齡左右［1］，韓永剛等用殘數(shù)法推測(cè)首免日齡為30 d［2］，另有研究表明，28 ～35 日齡首免可達(dá)到較好的保護(hù)效果［3］。這些研究對(duì)于分析仔豬豬瘟母源抗體變化規(guī)律，制定科學(xué)免疫程序具有重要實(shí)踐意義。為了更深入地分析母源抗體與保護(hù)效果，本文從母源抗體、中和抗體、攻毒保護(hù)等方面進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用豬:10頭母豬及所產(chǎn)的10窩仔豬(每窩用5頭，共計(jì)50頭)，免疫對(duì)照豬、非免疫對(duì)照豬，均來自北京某規(guī)?；N豬場(chǎng)。所有仔豬在14 d斷奶。日本大耳白兔:購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，均重1.5～2.5 kg。

1.1.2 試劑與種毒 豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒:為IDEXX公司產(chǎn)品。CSFV RT－nPCR檢測(cè)試劑:本實(shí)驗(yàn)室制備［4］。HCLV種毒:為本實(shí)驗(yàn)室制備，毒價(jià)5 ×103RID/0.1mL。

1.2 方法

1.2.1 斷奶時(shí)母豬抗體測(cè)定 在仔豬斷奶當(dāng)天，抽取10頭母豬及仔豬血液，分離血清，按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32 稀釋，用豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)母豬抗體及仔豬母源抗體水平。

1.2.2 仔豬母源抗體測(cè)定 為明確母源抗體在仔豬體內(nèi)的消長規(guī)律，采用5頭母豬所產(chǎn)的5窩仔豬(每窩選3～5頭，共18頭)，在在仔豬斷奶當(dāng)天及以后不同日齡用豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清抗體。以阻斷率50%分析仔豬抗體水平合格率。

1.2.3 仔豬攻毒實(shí)驗(yàn) 分81日齡和35日齡兩個(gè)組進(jìn)行，隨機(jī)挑選1#～5#母豬所產(chǎn)的12頭仔豬(每窩2～3頭)在81日齡(81日齡組)、6#～10#母豬所產(chǎn)的25頭仔豬在35日齡(35日齡組)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每頭仔豬肌肉注射石門毒(劑量為4×103.84TCID50)，同時(shí)用6頭疫苗免疫豬作對(duì)照。攻毒當(dāng)天采血，分離血清，檢測(cè)ELISA抗體;攻毒后測(cè)定體溫變化。81日齡組養(yǎng)至20 d淘汰，對(duì)死亡豬和耐過豬均采集全血及頜下淋巴結(jié)，用CSFV RT－nPCR檢測(cè)豬瘟病毒;35日齡組養(yǎng)至27 d，在攻毒后7 d、16 d時(shí)采血進(jìn)行RT－nPCR檢測(cè)，并在27 d時(shí)將所有豬淘汰，攻毒后無論是死亡豬還是耐過豬，均采集全血及頜下淋巴結(jié)，用CSFV RT－nPCR檢測(cè)豬瘟病毒。

1.2.4 中和抗體測(cè)定 取35日齡組攻毒當(dāng)天的部分血清樣本，用生理鹽水按 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀釋，然后與病毒液(100 RID/mL)等量混合，10～15℃作用1.5 h。期間振搖2～3次。同時(shí)設(shè)不加血清，只加等量生理鹽水的對(duì)照組。中和完畢，試驗(yàn)組各注射大耳白兔2只，對(duì)照組4只，每只耳靜脈注射1 mL，緩慢推進(jìn)。48 h內(nèi)每天測(cè)溫兩次，48 h后，每6 h測(cè)一次，測(cè)至120 h。

2 結(jié)果

2.1 母豬血清抗體ELISA結(jié)果 在仔豬產(chǎn)后14 d斷奶時(shí)采樣檢測(cè)，結(jié)果見圖1。

圖1 10頭母豬抗體水平測(cè)定結(jié)果

可以看出，在斷奶時(shí)，除一頭毒豬血清抗體(7#)較低外，母豬血清抗體阻斷率2倍稀釋后都在50%以上，但稀釋后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血清抗體稀釋后仍然達(dá)到阻斷率50%的倍數(shù)在不同母豬之間卻變化較大，有3頭母豬血清抗體可稀釋至1∶64，而有2頭只能稀釋至1∶2，說明該豬場(chǎng)母豬抗體水平很不均衡。

2.2 母豬抗體與仔豬抗體水平關(guān)系 圖2結(jié)果表明:母豬抗體水平高，則仔豬母源抗體水平也相應(yīng)高，仔豬的母源抗體水平分布也比較一致。

圖2 仔豬母源抗體與母豬抗體水平關(guān)系

2.3 仔豬母源抗體消長結(jié)果 根據(jù)5窩仔豬血清抗體平均水平來看，仔豬抗體在斷奶后呈緩慢下降趨勢(shì)，在60 d后，下降較為明顯，但有1窩仔豬的抗體水平一直較低(圖3a);從群體水平來看，在60 d時(shí)仍然有67%(12/18)的個(gè)體抗體阻斷率在50%以上(圖3b)。

圖3 仔豬母源抗體水平測(cè)定圖

2.4 仔豬攻毒結(jié)果

2.4.1 81日齡仔豬攻毒結(jié)果 攻毒后，所有豬的體溫均上升，并伴有食欲不振等臨床現(xiàn)象，但有9頭豬死亡，3頭豬耐過，且體溫恢復(fù)正常。9頭死亡豬只的血清抗體阻斷率在8.32% ～60.47%，而3頭耐過豬只的血清抗體阻斷率在20.71% ～49.01%，與死亡豬無明顯區(qū)別。不管是死亡豬還是耐過豬，RT－nPCR檢測(cè)結(jié)果全為陽性。

2.4.2 35日齡仔豬攻毒結(jié)果 對(duì)35日齡仔豬攻毒后，部分豬的體溫出現(xiàn)一過性上升，但食欲較好，免疫對(duì)照組攻毒后體溫正常。25頭非免疫豬中有3頭豬死亡，但經(jīng)解剖和PCR檢測(cè)，這三頭豬出現(xiàn)心包炎，腹膜粘連，沒有典型的豬瘟癥狀，也未檢測(cè)到豬瘟抗原。說明不是豬瘟病毒引起的死亡，疑似豬傳染性胸膜肺炎引起的死亡。攻毒后16 d時(shí)采血進(jìn)行RT－nPCR檢測(cè)，有9頭豬呈PCR陽性，在攻毒后27 d時(shí)將全部豬放血致死，對(duì)血和頜下淋巴結(jié)進(jìn)行PCR檢測(cè)，尚有2頭豬呈PCR陽性(表2)。由此推測(cè)，35日齡時(shí)母源抗體不能完全抵抗強(qiáng)毒實(shí)驗(yàn)感染，盡管豬能存活，但卻增加了豬群帶毒風(fēng)險(xiǎn)。

表1 81日齡仔豬攻毒結(jié)果

2.5 仔豬血清中和效價(jià)測(cè)定 結(jié)果見表3。有3頭豬的血清中和效價(jià)在1∶4或1∶4以下，有3頭豬的為1∶8，有1頭豬為116，而免疫對(duì)照豬為1∶16。

表2 35日齡仔豬攻毒結(jié)果

表3 仔豬血清兔體中和效價(jià)分布

3 討論

C株弱毒疫苗被譽(yù)為控制豬瘟的“金標(biāo)準(zhǔn)”疫苗，能誘導(dǎo)針對(duì)不同強(qiáng)毒株和各種基因群的免疫保護(hù)［5－7］，臨床保護(hù)率可達(dá) 100%［8－9］，免疫豬能抵抗不同模式的強(qiáng)毒攻擊［10］，為豬瘟防控發(fā)揮了重要作用。但實(shí)踐中豬瘟免疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，除受免疫抑制病的影響外，免疫程序不科學(xué)，母源抗體干擾等因素也會(huì)影響免疫效果。結(jié)合本研究，筆者認(rèn)為應(yīng)注意以下問題:

抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法是中和試驗(yàn)，但是，病毒中和試驗(yàn)操作復(fù)雜、影響因素多［11］，不適宜大規(guī)模應(yīng)用。而ELISA因其操作簡單和快速而在生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中大量應(yīng)用。據(jù)早期文獻(xiàn)報(bào)道，仔豬中和抗體低于1∶16或等于1∶16為危險(xiǎn)線，即豬瘟強(qiáng)毒攻擊會(huì)出現(xiàn)癥狀［12］，仔豬抗體1∶32以上，多數(shù)豬能抵抗豬瘟強(qiáng)毒攻擊［13］。但按1973版《獸醫(yī)生物藥品制造和檢驗(yàn)規(guī)程》測(cè)定兔體中和效價(jià)多用固定兔毒20 RID/mL，注射劑量僅為10 RID/只，而現(xiàn)行規(guī)程中固定兔毒為至少100 RID/mL，如果按此量推算，按目前規(guī)程測(cè)定的兔體中和效價(jià)，1∶8～1∶16可定為臨界線。在本研究中可看出，仔豬母源抗體ELISA測(cè)定值與中和效價(jià)有一定平行性但并不完全對(duì)等，仔豬體內(nèi)母源兔體中和效價(jià)從﹤1∶4到1∶16不等，但1∶8居多，此時(shí)攻毒全部豬能存活。但對(duì)于母源抗體水平較低的豬，盡管能存活，但帶毒時(shí)間相對(duì)較長。C株疫苗免疫后，可很快誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，免疫后早期雖然檢測(cè)不到中和抗體，但豬卻能抵抗強(qiáng)毒的攻擊，說明免疫早期細(xì)胞免疫的作用更加重要。豬瘟疫苗的免疫保護(hù)期可達(dá)18個(gè)月以上［14－15］，如果接種后晚些時(shí)間攻毒，豬群中和抗體水平與攻毒保護(hù)之間呈現(xiàn)一定相關(guān)性［16－17］。目前，許多規(guī)模化豬場(chǎng)將豬瘟疫苗初免時(shí)間為20日齡，個(gè)別豬場(chǎng)提前至15日齡。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，建議采用30日齡首免。

豬瘟疫苗種類多，抗原含量差距較大，執(zhí)行統(tǒng)一免疫程序有難度。因此，規(guī)模化種豬場(chǎng)制訂免疫程序最好以群體抗體檢測(cè)結(jié)果為依據(jù)。另外，母豬群的免疫水平及均勻性，直接關(guān)系到仔豬群的群體免疫效果。因此，做好種豬群免疫，對(duì)于穩(wěn)定仔豬免疫水平非常重要。值得注意的是，種豬群中有部分母豬抗體水平較低，這些豬很可能發(fā)生了先天感染或免疫耐受［13］，對(duì)此類種豬要堅(jiān)決淘汰，避免發(fā)生免疫失敗現(xiàn)象。

豬瘟綜合控制是一個(gè)復(fù)雜的工程，免疫預(yù)防是目前控制豬瘟的重要手段，在使用疫苗的同時(shí)，應(yīng)配合良好的檢測(cè)手段、以群體抗體水平來評(píng)價(jià)和優(yōu)化免疫程序，才能保證豬瘟免疫效果。以凈化豬公豬、種母豬和后備母豬為主，淘汰豬瘟病原陽性豬和抗體陰性豬，結(jié)合調(diào)整豬瘟免疫程序、加強(qiáng)隔離消毒、改善設(shè)施、環(huán)境治理等綜合性措施、協(xié)同控制其它疫病的綜合控制措施對(duì)我國比較適用。

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