熊膽粉在麝香通心滴丸抗動(dòng)脈粥樣硬化中的作用研究1）

賈成林，熊敏琪，崔金剛，王培偉，沈 融，朱玉陵，王文健，陳 瑜，張 騰

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種血管慢性炎癥病變，已經(jīng)成為誘發(fā)心血管疾病的重要因素，嚴(yán)重影響著人類健康。據(jù)調(diào)查，我國心血管疾病患病率男性為1.78%，女性為1.10%，且患病率隨年齡升高而增加。據(jù)估計(jì)，全國心血管疾病患者約有2.3億人，每100個(gè)成年人中有20人患心血管疾病。全國每年因其死亡人數(shù)約350萬人，每天因心血管病死亡9 590人，估計(jì)每分鐘就有6人死于心血管疾?。?］。因此對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治已成為當(dāng)今社會(huì)的首要任務(wù)。

麝香通心滴丸源于古方，有悠久的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，具有芳香益氣通脈、活血化瘀止痛，清熱解毒等功效，在Ⅲ期臨床觀察治療冠心病的研究中獲得了良好的療效。與冠心蘇合香丸等其他臨床用于冠心病治療的中成藥比較，最大的特點(diǎn)為“涼開法”，而動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中，痰熱瘀結(jié)是其重要的病理產(chǎn)物和致病因素，熊膽粉作為麝香通心滴丸的主要成分，味苦，性寒，具有清心、清熱、化瘀之功，可能是其“涼開”特點(diǎn)的代表，近代藥理學(xué)研究也提示，熊膽具有清熱解毒、抑菌抗炎等作用。因此，本研究采用特異性基因敲除小鼠結(jié)合高脂飲食復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，探究熊膽粉在麝香通心滴丸抗動(dòng)脈粥樣樣硬化中的作用，為其涼開法治療特點(diǎn)及臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 以C57BL／6J小鼠為背景的ApoE－／－小鼠30只，體重（22.95±0.14）g，C57BL／6J小鼠9只，體重（24.10±0.28）g，均為雄性，8周齡，SPF 級(jí)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 藥物及試劑 麝香通心滴丸全方藥用浸膏、去熊膽粉浸膏、熊膽粉，均由內(nèi)蒙古康恩貝藥業(yè)有限公司圣龍分公司提供。實(shí)驗(yàn)前，所有藥物均溶于生理鹽水，終濃度：麝香通心滴丸全方濃度30mg／kg，拆方（為麝香通心滴丸去熊膽粉）30 mg／kg，熊膽粉濃度0.33mg／kg。血脂檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.3 儀器設(shè)備 冰凍切片機(jī)（型號(hào)：CM3050s，Leica）；正置顯微鏡（型號(hào)：DM2000，Leica）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma）；微量臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf）；Image－Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics）

1.4 動(dòng)物分組及給藥 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，ApoE－／－小鼠隨機(jī)分為4組，分別為復(fù)方組、拆方組、熊膽粉組（每組7只）及模型組（9只），均給予高脂飲食（含有20%脂肪，其中1.5%為膽固醇）。C57小鼠設(shè)為正常組，9只，普通飲食喂養(yǎng)。治療組分別給予麝香通心滴丸水溶液0.2mL、拆方水溶液0.2mL、熊膽粉水溶液0.2mL；模型組及正常組給予等體積生理鹽水。各組均為灌胃給藥，每天定點(diǎn)給藥1次，連續(xù)8周。

1.5 動(dòng)物處理及病理形態(tài)學(xué)觀察 連續(xù)給藥8 周后，停止給藥，末次給藥后次日，各組小鼠眶周靜脈叢采血后處死，并分離主動(dòng)脈，將主動(dòng)脈弓垂直向上，OCT包埋，干冰速凍后，再轉(zhuǎn)入－80度冰箱，然后制成10μm 切片，行HE 染色、油紅O 染色及Masson’s Trichrome染色來觀察病理形態(tài)學(xué)的改變，用Image－Pro Plus軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 血清血脂水平檢測 外周血中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（HDL）和高密度脂蛋白（LDL）均用生化法檢測，步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組ApoE－／－小鼠主動(dòng)脈病理結(jié)果

2.1.1 HE染色 正常組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜上幾乎沒有斑塊形成，模型組與之相比斑塊顯著增多（P＜0.01）；3個(gè)給藥組與模型組對(duì)比，斑塊均有不同程度的減小，經(jīng)過量化后的斑塊相對(duì)面積，復(fù)方組與模型組比較（P＝0.043），拆方組與模型組比較（P＝0.049），熊膽粉組與模型組比較（P＝0.035），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以熊膽粉組作用最明顯。

2.1.2 油紅O 染色 油紅O 能特異地結(jié)合脂質(zhì)形成可見的紅色，從而初步判定損傷范圍。與正常組對(duì)比，模型組的損傷面積顯著增加（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，3個(gè)給藥組的損傷面積均顯著減小（P＜0.01）。量化后復(fù)方組和熊膽粉組的效果均很明顯，去掉熊膽粉后的拆方組效果比其余兩組弱。

2.1.3 Masson’s Trichrome染色 Masson’sTrichrome染色可以用來判定斑塊纖維化的程度。與正常組相比，模型組纖維化 程 度 顯 著 增 強(qiáng)（P ＜0.01）；與 模 型 組 相 比，復(fù) 方 組（P ＝0.0046）、拆方組（P＝0.0175）和熊膽粉組（P＝0.0152）的纖維化面積均有明顯的減少。

2.2 熊膽粉對(duì)ApoE－／－小鼠的血脂水平的影響（見表1） 與正常組相比，模型組小鼠血清TC、TG和LDL水平顯著升高（P＜0.01）；HDL水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，復(fù)方組、拆方組和熊膽粉組小鼠血清TC、TG 和LDL 水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；HDL水平顯著升高（P＜0.01）。

表1 熊膽粉對(duì)ApoE－／－小鼠血脂水平的影響 mmol／L

表1 熊膽粉對(duì)ApoE－／－小鼠血脂水平的影響 mmol／L

與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別 n TC TG LDL HDL正常組 9 6.46±0.55 0.84±0.05 4.14±0.24 0.84±0.02模型組 9 15.87±0.391）2.82±0.081）10.22±0.361） 0.41±0.021）復(fù)方組 7 10.76±0.483）2.09±0.163） 7.28±0.333） 0.65±0.053）拆方組 7 11.54±0.883）2.09±0.133） 8.78±0.561）2）0.56±0.023）熊膽粉組7 11.66±0.953）2.13±0.123） 7.93±0.473） 0.57±0.033）

3 討 論

ApoE是血漿脂蛋白中重要的成分，在調(diào)節(jié)血漿膽固醇水平中起重要的作用，是高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要分子靶標(biāo)。ApoE 敲除小鼠能再現(xiàn)與人類ApoE 缺陷相似的特征，在給予高脂飲食后能自發(fā)的形成動(dòng)脈粥樣硬化［2］。選用ApoE－／－小鼠作為模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用ApoE－／－小鼠加高脂飲食造模，用藥物干預(yù)8周后，觀察到熊膽粉能夠減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊損傷面積，降低ApoE－／－小鼠血脂水平，在全方抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)中起到了重要作用。

麝香通心滴丸是依據(jù)古方“至寶丹”“六神丸”化裁而來，主要由麝香、人參莖葉總皂苷、丹參、熊膽粉等藥物組成。熊膽，作為中國四大動(dòng)物藥材之首（熊膽、麝香、虎骨、牛黃）之首，素有“藥中黃金”之美譽(yù)。熊膽入藥已有一千三百多年的歷史，始載于中國唐朝蘇敬的《新修本草》，明朝李時(shí)珍的《本草綱目》記載，熊膽味苦、性寒，歸肝膽心經(jīng)，無毒，具有清心、解熱、利膽、明目等功效。近代藥理學(xué)研究證實(shí)，熊膽具有清熱解毒、抑菌抗炎、保肝護(hù)肝、利膽溶石、降脂降壓等作用［3，4］。

致動(dòng)脈粥樣硬化的重要原因之一就是血脂水平異常，在長期高脂血癥的情況下，氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）和膽固醇最容易對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜產(chǎn)生功能性損傷，使內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面的特性發(fā)生改變［5］，而且研究發(fā)現(xiàn)主要是低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）水平與AS的發(fā)生呈正相關(guān)，其機(jī)制是LDL 可以通過apoB100與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用沉積在動(dòng)脈內(nèi)膜下形成粥樣硬化斑塊［6］。相反，在流行病學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)血漿HDL 水平與動(dòng)脈粥樣樣硬化性心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)成反比關(guān)系［7］。而且，有研究發(fā)現(xiàn)，HDL能促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇的外流［8］，這能降低巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞的形成。因此升高血漿中HDL 水平，降低LDL會(huì)對(duì)AS的發(fā)展起到一定的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)麝香通心滴丸具有顯著的降低血清中TC、LDL 及TG 含量，升高HDL水平的作用。去除了熊膽粉的拆方組雖然也有降脂作用，但作用明顯不及全方，特別是去掉熊膽粉后降低LDL 的作用顯著下降，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，熊膽粉在協(xié)助麝香通心滴丸調(diào)節(jié)血脂的過程中發(fā)揮了重要作用。

本研究采用ApoE－／－小鼠，觀察熊膽粉、復(fù)方、拆方對(duì)粥樣斑塊病理損傷的干預(yù)，以及調(diào)節(jié)血脂水平的作用，提示在麝香通心滴丸抗動(dòng)脈粥樣硬化的過程中，熊膽粉發(fā)揮了重要作用，是其涼開的關(guān)鍵組分，有關(guān)其涼開的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。

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