丹參注射液對(duì)腦梗死大鼠SVZ干細(xì)胞增殖作用的研究

林 惠，楊萬(wàn)章

丹參注射液是丹參的水溶性復(fù)合物，也是丹參活血化瘀的主要成分，在預(yù)防和治療腦血管疾病中顯示了重要性。丹參注射液能上調(diào)腦梗死大鼠腦組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及外周血腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（BDNF）的表達(dá)［1，2］，對(duì)血管新生和神經(jīng)重塑有積極作用。本文在前期研究的基礎(chǔ)上觀察不同時(shí)間點(diǎn)丹參注射液對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能和室管膜下區(qū)（SVZ）溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）＋／巢蛋白（nestin）細(xì)胞表達(dá)的影響，旨在探討丹參注射液治療腦梗死的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠60只，體重（250～300）g，周齡（8～10）周，由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2008－0002。

1.2 局灶性腦梗死模型建立 采用經(jīng)改良頸總動(dòng)脈線栓法［3］制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）致局灶性永久性腦缺血梗死模型。大鼠手術(shù)后12h根據(jù)ZealLonga的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分［4］，丹參注射液組及生理鹽水組均選取1分～3分者為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，假手術(shù)組只剪開(kāi)頸部中央，暴露頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，但不予大腦中動(dòng)脈阻斷。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 剔除因麻醉和手術(shù)意外死亡及未達(dá)模型標(biāo)準(zhǔn)的大鼠后，將符合模型標(biāo)準(zhǔn)的MCAO 大鼠24只隨機(jī)分為丹參注射液組和生理鹽水組，每組12只，兩組大鼠再隨機(jī)分為治療7d、14d，每個(gè)亞組6只。另外隨機(jī)取12只大鼠作假手術(shù)組，隨機(jī)分為7d、14d，每個(gè)亞組6只。

1.4 治療方法 丹參注射液組大鼠入選術(shù)后12h開(kāi)始連續(xù)使用注射丹參注射液（杭州正大青春寶藥業(yè)公司，生產(chǎn)批號(hào)：1208181），腹腔注射，每次2mL，1次／日，治療7d、14d。生理鹽水組大鼠入選后12h開(kāi)始連續(xù)使用與丹參注射液等劑量的生理鹽水，連用7d、14d。假手術(shù)組不給任何治療。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)定 改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分（mNSS）［5］：分別在丹參注射液及生理鹽水治療前、治療7d、14d時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)定。該量表包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡功能的綜合性評(píng)分指標(biāo)。通過(guò)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)、感覺(jué)試驗(yàn)、平衡木試驗(yàn)反射喪失和不正常運(yùn)動(dòng)，綜合評(píng)價(jià)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的嚴(yán)重程度，4個(gè)項(xiàng)目的總和為最終評(píng)分。嚴(yán)重?fù)p傷評(píng)分為18分～13分；重度損傷評(píng)分為12分～7分；輕度損傷評(píng)分為6分～1分。

1.6 TTC染色 動(dòng)物治療療程結(jié)束時(shí)，斷頭取腦，置于－20℃冰箱中速凍20min；避光配制2%的TTC溶液。取出成功染色的腦片，放置于掃描機(jī)上掃描圖片。

1.7 BrdU 注射及冰凍切片制作 治療后分別于7d、14d處死大鼠。處死前3d開(kāi)始腹腔注射BrdU 每天2次，每次間隔8h。取腦標(biāo)本時(shí)予大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，快速?gòu)淖笮氖夜嘧⒘姿峋彌_液（PBS，1M）100 mL，再灌注4%多聚甲醛100 mL后取腦。冰凍切片用包埋組織劑包埋。將收集的SVZ腦片置于含疊氮化鈉的PBS溶液中放置4°冰箱保存。

1.8 免疫熒光染色及檢測(cè)BrdU＋／nestin＋、GFAP＋／nestin＋細(xì)胞 選擇大腦切片放于24孔板中，PBS漂洗。封閉液封閉非特異抗原1h，吸干封閉液，分別加入BrdU 稀釋液，GFAP稀釋液后放置4°冰箱孵育24h；冰箱取出后PBS漂洗，加入對(duì)應(yīng)的熒光 二抗，驢抗綿羊（1∶200，Dylight488，Abcam公司），驢抗兔（1∶200，AF488，Abcam 公司生產(chǎn)）稀釋液，室溫避光孵育2h；雙染時(shí)，PBS漂洗，分別加入nestin（小鼠多抗，1∶400，Abcam公司），室溫中避光孵育3h后PBS漂洗，加入對(duì)應(yīng)的二抗，驢抗小鼠（1∶200，AF594，Abcam 公司）室溫中孵育1.5h，PBS 漂洗，含DAPI防熒光淬滅液封片，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡（Leica SP5）拍片統(tǒng)計(jì)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件，統(tǒng)計(jì)雙側(cè)SVZ的BrdU＋／nestin＋、GFAP＋／nestin＋細(xì)胞數(shù)。參照Kuhn等［6，7］方法，計(jì)算雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。滿足正態(tài)性和方差齊性后，采用配對(duì)t檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)性和方差齊性時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)；SVZ區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。確定方差齊性后，組間比較采用LSD法，若方差不齊，組間比較采用Dunnetts’C法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)評(píng)定 假手術(shù)組大鼠麻醉蘇醒后活動(dòng)正常，mNSS評(píng)分為0分。治療前丹參注射液組和生理鹽水組mNSS評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后丹參注射液組與生理鹽水組mNSS評(píng)分均降低，大鼠神經(jīng)功能均趨于好轉(zhuǎn)；在7d、14d，丹參注射液組mNSS評(píng)分顯著低于生理鹽水組（P＜0.05），丹參注射液能明顯改善腦梗死后大鼠的功能障礙。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能總評(píng)分比較分

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能總評(píng)分比較分

與本組治療前比較，1）P＜0.05；與丹參注射液組同時(shí)間點(diǎn)比較，2）P＜0.05

組別 n 治療前 治療后第7天 治療后第14天丹參注射液組 12 10.08±0.79 4.50±0.551） 2.83±0.411）生理鹽水組 12 10.41±1.08 6.83±0.411）2）5.83±0.751）2）

2.2 腦梗死大鼠雙側(cè)SVZ的BrdU 表達(dá) TTC染色驗(yàn)證模型成功，梗死灶在左側(cè)大腦皮層。梗死后同時(shí)間點(diǎn)雙側(cè)SVZ 的BruU＋細(xì)胞數(shù)沒(méi)有差異。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異；在治療后7d、14d丹參注射液組BrdU＋細(xì)胞均顯著高于生理鹽水組和假手術(shù)組（P＜0.05）。治療后第14天與7天比較BrdU＋細(xì)胞有所下降，但丹參注射液組仍高于同期內(nèi)的生理鹽水組和假手術(shù)組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.3 丹參注射液對(duì)SVZ的NSCs增殖的影響 3組大鼠各時(shí)間點(diǎn)雙側(cè)SVZ的BrdU＋／nestin＋細(xì)胞占BrdU＋細(xì)胞的比率（陽(yáng)性率）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)SVZ的BrdU＋、BrdU＋／nestin＋細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療第7天、第14天丹參注射液組BrdU＋、BrdU＋／nestin＋細(xì)胞數(shù)與生理鹽水組，假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3組腦梗死大鼠各時(shí)間點(diǎn)雙側(cè)SVZ 均未發(fā)現(xiàn)GFAP＋／nestin＋細(xì)胞。詳見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)BrdU＋及BrdU＋／nestin＋細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性率比較個(gè)

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)BrdU＋及BrdU＋／nestin＋細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性率比較個(gè)

與丹參注射液組同時(shí)間點(diǎn)比較，1）P＜0.05

組別 n Br dU ＋ B第／7N天 陽(yáng)性率（%）BrdU＋第B／1N4 天 陽(yáng)性率（%）丹參注射液組 12 2 923±267 1 833±174 0.628±0.060 2 193±2741 220±142 0.583±0.064生理鹽水組 12 2 017±2381） 1 343±1101） 0.655±0.080 1 513±1681） 1 003±1441） 0.654±0.084假手術(shù) 12 1 120±801） 712±241） 0.645±0.084 1 093±1041） 712±311） 0.656±0.071

3 討 論

丹參為唇形科多年生草本植物的根，具有活血化瘀、養(yǎng)血安神、涼血消癰、排膿生肌等作用，丹參注射液是丹參的水溶性復(fù)合物，其主要成分是丹酚酸B 和丹參素，目前臨床已廣泛應(yīng)用于治療和預(yù)防腦血管疾?。?，9］。葉瑞印等［10］在丹參注射液對(duì)腦梗死患者內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）數(shù)量及活性的研究中對(duì)患者的靜脈血行EPCs培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，丹參注射液能提高腦梗死患者外周血EPCs數(shù)量，并增強(qiáng)EPCs增殖、遷移和黏附功能。鄧英光等［11］在丹參注射液聯(lián)合骨髓干細(xì)胞（MSCs）移植治療腦梗死肢體癱瘓的臨床研究中，發(fā)現(xiàn)其顯著緩解癱瘓肢體癥狀，丹參注射液聯(lián)合MSCs治療急性腦梗死安全可行。

本研究顯示，在急性腦缺血損傷后，SVZ的細(xì)胞發(fā)生增殖，增殖細(xì)胞在缺血后7d達(dá)到高峰，治療14d后仍可以看到細(xì)胞增殖，丹參注射液能改善大鼠的神經(jīng)功能，增強(qiáng)nestin的表達(dá)。Nestin是1985年發(fā)現(xiàn)的一種由胚胎大鼠脊神經(jīng)管神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的一種蛋白質(zhì)［12］。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷后，SVZ 的GFAP表達(dá)增多，GFAP是星形細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，在星形細(xì)胞中有豐富的、唯一的表達(dá)，在缺血損傷時(shí)，刺激成熟星形細(xì)胞合成GFAP，GFAP主要用于標(biāo)記損傷后膠質(zhì)活動(dòng)［13］。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦梗死中具有重要的作用，其代謝特性表現(xiàn)為可在腦梗死早期吞噬細(xì)胞外的有害神經(jīng)介質(zhì)，以維持腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定。丹參注射液對(duì)于促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)再生、減輕組織損傷等方面發(fā)揮作用；丹參注射液中酚酸類單體丹酚酸B 具有抗氧化，清除自由基的作用［14］，可以改善干細(xì)胞的自我更新、增殖和分化所依賴的周圍特殊微環(huán)境；且丹參注射液促進(jìn)SVZ 的NSCs增殖，同時(shí)增殖的細(xì)胞產(chǎn)生和釋放細(xì)胞因子有助于改善腦損傷后微環(huán)境，促進(jìn)干細(xì)胞的存活［15］。

（附：本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物采購(gòu)到完成均在中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行）。

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