卡托普利對(duì)心梗后心衰大鼠尿液代謝組學(xué)的影響1）

李琪琳，褚瑜光，胡元會(huì)，劉瑞華，王映紅，苗朝霞

代謝組學(xué)是研究生物體受病理生理刺激或基因改變而引起的體內(nèi)代謝物動(dòng)態(tài)變化的一門(mén)科學(xué)，其研究的技術(shù)和方法日趨成熟，在病變標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、疾病的診斷和治療、藥物藥效及毒理安全性評(píng)價(jià)等方面得到了廣泛的應(yīng)用［1－3］。ACEI類藥物被公認(rèn)為治療心力衰竭的重要藥物，卡托普利作為ACEI的代表，已被證實(shí)其可以有效抑制RAAS，限制心室重構(gòu)，降低心衰患者的發(fā)病率和死亡率［4］。本研究采用1H－NMR 技術(shù)研究卡托普利對(duì)心梗后心衰大鼠尿液代謝組學(xué)的影響，進(jìn)一步探討卡托普利治療心衰的機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常雄性SD 大鼠20只（體重200g～250g），購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012－0001），分籠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物房。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 卡托普利（批號(hào)：20100329）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Bruker AVANCE Ⅲ－600 MHz超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振波譜儀（Bruker Corporation，Switzerland），主要配置：場(chǎng)強(qiáng)為11.75T（500MHz）的超導(dǎo)磁體，1H／13C／31P／19F四核探頭、梯度反相探頭（109Ag－31P）、固體高分辨魔角旋轉(zhuǎn)探頭（15N－31P）；HX－200 動(dòng) 物 呼 吸 機(jī)（成 都 泰 盟 科 技 有 限 公 司）；Value plus 系 列 超 低 溫 冰 箱（Thermo Revco，USA）；Cenirifuge5415D 臺(tái)式低溫1－15pk超速離心機(jī)（Eppendorf－MiniSpin／plus，German）。

1.4 動(dòng)物模型復(fù)制 參照Pfeffer［5］報(bào)道的方法復(fù)制心衰動(dòng)物模型。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 動(dòng)物購(gòu)回后喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)合成飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，禁食12h后造模。術(shù)后24h對(duì)模型大鼠行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，以射血分?jǐn)?shù)（EF）減損＞15%為入選標(biāo)準(zhǔn)。將入選模型大鼠隨機(jī)分為模型組、卡托普利組，每組大鼠不少于6只。

1.6 實(shí)驗(yàn)給藥 模型組生理鹽水4.0ml／kg灌胃，每天一次；卡托普利組100mg／kg溶于生理鹽水中灌胃。各組連續(xù)給藥8周。

1.7 尿液采集及處理 各組大鼠灌胃8周后，以代謝籠收集大鼠24h尿液，經(jīng)4℃，12 000r／min離心15min，取上層尿液，于－80℃冰箱中保存。室溫解凍后取20μL上清，添加D2O：H2O 為1∶9和0.05%TSP的混合液40μL，最后將制備好的尿液樣品加入1.7 mm 核磁樣品管中，使用Bruker AVANCE Ⅲ－600 MHz超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振波譜儀進(jìn)行測(cè)量。

1.8 數(shù)據(jù)采集和處理 分別采用弛豫時(shí)間編輯（Carr－Purcell－Meiboom－Gill，CPMG）和 擴(kuò) 散 編 輯（longitudinal eddy－delay，LED）脈沖序列檢測(cè)尿液中小分子及大分子代謝物。在超導(dǎo)傅立葉變換NMR 儀上調(diào)用NOE 相關(guān)2D－NMR 譜（nuclear overhauser effect spectroscopy，NOESY）脈沖序列，設(shè)置參數(shù)。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：譜寬8 000Hz，預(yù)飽和時(shí)間為2s，采樣點(diǎn)數(shù)32k，累加次數(shù)128次，預(yù)飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。自由感應(yīng)衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）信號(hào)經(jīng)過(guò)填零為32k點(diǎn)后，再加上0.5Hz的線增寬因子，經(jīng)傅立葉變換轉(zhuǎn)為1H－NMR 圖譜。以TSP的化學(xué)位移參考峰的位置，設(shè)為0。調(diào)用AMIX（Analysis of MIXtures software v.3.0，Bruker Biospin）軟件中的程序?qū)?.5～6ppm 范圍內(nèi)的圖譜按照每段0.04ppm 進(jìn)行分段積分。將積分按每張譜的總積分強(qiáng)度歸一化。然后以Excel文件貯存，用于模式識(shí)別分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)輸入到SIMCA－P12.0軟件中進(jìn)行主成分分析（PCA），為了鑒別區(qū)分各組間對(duì)代謝輪廓貢獻(xiàn)較大的代謝物，將數(shù)據(jù)進(jìn)行正交信號(hào)校正處理，然后進(jìn)行偏最小二乘法－判別分析，即O－PLS－DA。結(jié)果以得分圖和載荷圖體現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 卡托普利組與模型組代謝圖譜分析 由PCA 得分圖看出，兩組小分子（圖1）及大分子（圖2）代謝圖譜均能明顯區(qū)分，小分子圖譜解釋度R2Y＝0.926，大分子圖譜解釋度R2Y＝0.891，說(shuō)明PCA 模型對(duì)樣本解釋度較高。采用OPLS－DA 對(duì)兩組間差異代謝物進(jìn)行分析得出，與模型組相比，卡托普利組谷氨酰胺、肌肝、?；撬?、檸檬酸、蘋(píng)果酸、苯基丙氨酸含量升高；3－羥基丁酸、乙酸、丙酮、磷脂酰膽堿、三甲胺、馬尿酸含量下降。結(jié)果提示卡托普利能有效調(diào)節(jié)心衰大鼠尿液代謝紊亂，并促使代謝表型向正常范圍回歸。

圖1 卡托普利組與模型組大鼠尿液低場(chǎng)區(qū)代謝物變化模式識(shí)別得分圖及載荷圖

圖2 卡托普利組與模型組大鼠尿液高場(chǎng)區(qū)代謝物變化模式識(shí)別得分圖及載荷圖

2.2 卡托普利組與模型組差異代謝物變化 采用OPLS－DA對(duì)組間差異代謝物進(jìn)行分析，結(jié)合主成分載荷圖，確定以下物質(zhì)（見(jiàn)表1）對(duì)分類貢獻(xiàn)較大。

表1 差異代謝物變化表

3 討 論

作為各種心臟病的終末段，心力衰竭的高患病率、高死亡率儼然已使其成為人類共同面對(duì)的一個(gè)公共健康問(wèn)題。心力衰竭的一個(gè)基本病理機(jī)制為心室重塑，因此，對(duì)于心力衰竭進(jìn)行有效治療，關(guān)鍵在于對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過(guò)渡激活狀況予以阻斷，避免出現(xiàn)心室重塑。ACEI是目前公認(rèn)治療心衰的基石之一，作為一個(gè)比較常用的ACEI制劑，卡托普利不但可以抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，使AngⅡ生成減少，擴(kuò)張外周血管，減輕心臟前后負(fù)荷，還可以抑制緩激肽的降解，激活磷脂酶A，增加前列腺素水平，抑制RAAS，使β受體密度上調(diào)，防治左室重構(gòu)；同時(shí)，還能抑制交感神經(jīng)活性，糾正心衰患者的電解質(zhì)紊亂，使血鉀、血鈉、血鎂維持正常，從而降低心律失常及猝死的發(fā)生率［6］。但是，卡托普利治療心衰是否存在其他作用機(jī)制，代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為從代謝的角度揭示心衰病理生理學(xué)過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化以及它們所包含的生物學(xué)意義提供了新的工具和方法，也為探索ACEI制劑治療心衰的作用機(jī)制提供了新的靶點(diǎn)和思路。

本實(shí)驗(yàn)利用1H－NMR代謝組學(xué)技術(shù)，通過(guò)對(duì)心衰大鼠代謝物圖譜進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析和模式識(shí)別處理，觀察了卡托普利對(duì)心衰大鼠尿液代謝的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，根據(jù)PCA 得分圖，模型組與卡托普利組兩組小分子及大分子代謝圖譜能明顯區(qū)分，提示卡托普利能調(diào)節(jié)心衰大鼠代謝紊亂，并促使代謝表型向正常范圍回歸。

卡托普利組與模型組對(duì)比：與能量代謝相關(guān)的檸檬酸、蘋(píng)果酸含量升高；與糖、脂代謝有關(guān)的化合物有3－羥基丁酸、丙酮、乙酸、磷脂酰膽堿等濃度降低，與氨基酸代謝有關(guān)的化合物有谷氨酰胺、苯基丙氨酸、?；撬釢舛壬?。可見(jiàn)，心梗后心衰大鼠尿液代謝組學(xué)出現(xiàn)比較明顯的糖、脂、氨基酸、能量代謝紊亂，卡托普利可以有效調(diào)節(jié)心衰大鼠尿液代謝紊亂，這可能是其治療心衰的作用機(jī)制之一，但其具體的作用途徑有待進(jìn)一步研究。

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［6］ 伍尚強(qiáng).卡托普利對(duì)心力衰竭患者的臨床療效觀察［J］.中國(guó)醫(yī)療前沿，2009，4（24）：12－13.