全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞LDH 活性、ET－1表達(dá)的影響1）

周牡娜，譚 茜，鄭潔鋼，鄒 茜，黃 鶯，彭延古

血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間重要的生理屏障，而且是高度活躍代謝庫，能分泌作用不同的活性物質(zhì)，以維持血管收縮和舒張、抗凝與促凝平衡［1］。隨著對血管內(nèi)皮功能進(jìn)一步的深入研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是導(dǎo)致多種心血管疾病發(fā)病的始動或促進(jìn)因素［2］。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時，其功能發(fā)生失調(diào)，會導(dǎo)致腦缺血、動脈粥樣硬化、心肌梗死、高血壓等心血管疾病的發(fā)生［3，4］。VEC作為一 種抗血栓形成細(xì)胞，其分泌的生物活性物質(zhì)在抗凝、纖溶和抗血小板活化等方面有重要的意義［5］。乳酸脫氫酶（LDH）是活細(xì)胞的內(nèi)含酶之一，其釋放率的變化可以體現(xiàn)出細(xì)胞膜通透性的改變，當(dāng)細(xì)胞膜受損嚴(yán)重時，胞漿中的LDH 將釋放到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中LDH 酶的活性會顯著升高，培養(yǎng)液中LDH 含量多少可反映細(xì)胞膜的損傷程度，因此細(xì)胞外液中的LDH 活性增加是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志之一［6］。內(nèi)皮素－1（ET－1）是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的一種血管活性肽，是調(diào)節(jié)血管舒縮功能的主要因子，是迄今所知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)［7］，可引起血管強(qiáng)烈收縮并刺激一些舒血管活性物質(zhì)的釋放、刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)、促進(jìn)成纖維細(xì)胞有絲分裂、調(diào)節(jié)血管通透性激活炎癥細(xì)胞等。全蝎具有熄風(fēng)鎮(zhèn)痙、消炎攻毒、通絡(luò)止痛，能抑制血小板的活化聚集、直接抑制凝血酶－纖維蛋白原反應(yīng)和促進(jìn)纖溶系統(tǒng)活性等因素，從而抑制血栓形成。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本研究以凝血酶－血管內(nèi)皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，探究全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)HUVEC釋放LDH、ET－1的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 超凈臺（SW－CJ－1CV，蘇凈安泰公）、倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，日 本）、CO2培 養(yǎng) 箱（SHEL－LAB，Hitachi，美國）、酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystens集團(tuán)）。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）武漢大學(xué)典型物種保存中心提供。胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），新生小牛血清（杭州四季青生物制品研究所產(chǎn)品）。磷酸緩沖鹽（PBS）干粉（武漢博士德公司產(chǎn)品）。凝血酶（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所產(chǎn)品）。全蝎（購于湖南省醫(yī)藥公司）經(jīng)水煮醇沉、凝膠過濾、離子交換層析等分離純化過程將其真空冷凍干燥成粉末，－20℃保存?zhèn)溆?，用RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清）配成所需濃度工作液，0.22μm 微孔濾膜過濾除菌。

1.2 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 將血管內(nèi)皮細(xì)胞加入RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清、100 U／mL 青霉素、100 U／mL 鏈霉素）中，體積分?jǐn)?shù)5%、37℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形或多角形、鋪路石樣鑲嵌式單層細(xì)胞排列，待細(xì)胞長成單層后，棄去培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，經(jīng)Ⅷ因子（FⅧ）免疫熒光鑒定并選擇生長良好的HUVECs用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理 選取生長良好的2～3 代內(nèi)皮細(xì)胞。將融合生長的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化吹打制成單細(xì)胞懸液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為7.5×104／mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL。37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞融合后，隨機(jī)分為：空白對照組（等量培養(yǎng)液），凝血酶刺激組（培養(yǎng)液＋10U／mL 凝血酶），全蝎純化液高、中、低劑量組（10U／mL 的凝血酶后分別＋24μg／mL、12 μg／mL、6μg／mL全蝎純化液）。每組設(shè)10個復(fù)孔，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h進(jìn)行檢測。

1.4 指標(biāo)檢測 采用比色法測定LDH 活性，試劑盒購自南京建成生物工程研究所；采用放射免疫法測ET－1的含量，試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。嚴(yán)格按試劑盒操作說明書操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)LDH 影響 與對照組比，凝血酶能明顯促進(jìn)HUVECs漏出LDH（P＜0.01），而全蝎純化液各組培養(yǎng)液中LDH 與凝血酶組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。LDH 漏出減少。詳見表1。

表1 全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放LDH、ET－1的影響

表1 全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放LDH、ET－1的影響

與空白組比較，1）P＜0.01；與凝血酶組比較，2）P＜0.01

組別 n LDH（U／L） ET－1（ng／L）空白組 10 651.21±106.32 12.10±0.98凝血酶組 10 1 560.37±201.231） 34.02±1.081）全蝎大劑量組 10 985.53±113.152） 14.36±0.882）全蝎中劑量組 10 1 123.16±139.612） 17.82±0.942）全蝎小劑量組 10 1 261.10±109.332） 19.62±0.962）

2.2 全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)HUVECs釋放ET－1的影響凝血酶刺激后ECV 分泌ET－1增加，培養(yǎng)上清液中ET－1含量顯著高于空白組（P＜0.01），而全蝎純化液各劑量組培養(yǎng)上清液中ET－1含量均顯著低于凝血酶組（P＜0.01）。詳見表1。表明凝血酶刺激ECV 可誘導(dǎo)其分泌增加，全蝎純化液對其分泌具有抑制作用。

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞存在于全身組織器官，連接組織和血液，作為最先感受機(jī)體內(nèi)環(huán)境變化的細(xì)胞之一，憑借對血管張力、炎癥、纖溶與凝血和對活性氧族的調(diào)節(jié)成為血管體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要參與者［8］。血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性是維持正常血流狀態(tài)、血管通透性及防御反應(yīng)的基礎(chǔ)，因此內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)促凝和抗凝平衡中起著舉足輕重的作用。內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)與多種疾病關(guān)系的重要方法，其抗血栓形成在血栓栓塞性疾病中的作用也得到公認(rèn)和證實(shí)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶屬氫轉(zhuǎn)移酶，主要催化體內(nèi)乳酸氧化成丙酮酸，是糖酵解過程中一種重要的酶。廣泛分布于人體組織中，是細(xì)胞代謝狀態(tài)非常敏感的指標(biāo)，可反映缺氧、無氧酵解、活性狀態(tài)和惡性轉(zhuǎn)化，任何原因引起的組織細(xì)胞損傷均可引起LDH 活性增加。正常情況下，血清LDH 的含量低于細(xì)胞組織的1‰，當(dāng)組織損傷或細(xì)胞代謝紊亂時，LDH 可從組織或細(xì)胞內(nèi)釋放到血液導(dǎo)致血清中LDH 活性顯著增加。故血清LDH 活性水平很大程度可以反映富含LDH 細(xì)胞的增殖、代謝等生物學(xué)性狀［9］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，凝血酶刺激HUVEC大量增加LDH 的漏出，提示凝血酶刺激ECV 后，細(xì)胞代謝活性降低，同時全蝎純化液各組培養(yǎng)液中LDH 與凝血酶比較，LDH 漏出減少，提示凝血酶可抑制ECV 代謝，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞LDH 的漏出，對內(nèi)皮細(xì)胞呈損傷作用，而全蝎純化液能抑制受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞的LDH 漏出。

內(nèi)皮素（ET）是由21個氨基酸組成的多功能生物活性肽，是血管內(nèi)皮損傷的重要標(biāo)志物。ET 有3種亞型，但只有ET－1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，是目前已知作用最強(qiáng)的內(nèi)源性血管收縮肽，ET－1有收縮血管、血小板聚集及平滑肌增殖等功能，能夠協(xié)同生長因子，促進(jìn)生長因子促平滑肌增殖。ET－1 與G 蛋白偶聯(lián)受體ET A 結(jié)合后，可介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞依賴的血管收縮效應(yīng)，若內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ET－1增多，可調(diào)控平滑肌增殖的細(xì)胞因子和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管疾病的加重［10，11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凝血酶刺激HUVEC大量釋放ET－1，而全蝎能明顯抑制凝血酶所誘導(dǎo)的ET－1釋放。全蝎純化液可抑制凝血酶誘導(dǎo)的LDH 漏出和ET－1的釋放，這可能是全蝎抗血栓形成的作用機(jī)制之一。

［1］ 易小民，譚茜，彭延古，等.全蝎純化液對凝血酶誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管性血友病因子和6－酮－前列腺素F1a的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2010，17（6）：334－336.

［2］ 田海濤，曹芳英，朱智明，等.心血管疾病不容忽視的問題：血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［J］.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志，2013，2（3）：173－176.

［3］ Panza JA，Quyyumi AA，Brush JE，et al.Abnormal endotheliumdependent vascular relaxa tion in patients with essential hypertension［J］.N Engl J Med，1990，323（1）：22－27.

［4］ 周穎，陳虹.血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂與心血管疾病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，6（8）：63－65.

［5］ 楊潔紅，張宇燕，王華鋒.養(yǎng)陰益氣活血方對培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抗凝和纖溶功能的作用［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2008，15（1）：3－5.

［6］ 郭晶，宋文華，丁峰.萘醌類化合物對HL－7702細(xì)胞LDH 釋放率以及線粒體膜電位的影響［J］.南開大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，45（4）：1－6.

［7］ 彭良富，楊期明，廖遠(yuǎn)高.偏頭痛患者血漿內(nèi)皮素－1含量的變化研究［J］.華夏醫(yī)學(xué)，2006，19（2）：252.

［8］ 喬華，何勝虎.血管內(nèi)皮細(xì)胞功能檢測方法及意義［J］.實(shí)用心腦肺血管志，2010，18（4）：531－533.

［9］ 鞏國亭，管洪在.急性淋巴細(xì)胞白血病患者血清IL－12、IFN－γ及LDH 測定的臨床意義［J］.山東醫(yī)藥，2007，47（4）：5－6.

［10］ Barton M.Reversal of proteinuric renal disease and the emerging role of endothelin［J］.Nat Clin Pract Nephro，2008，4（9）：490－501.

［11］ Zhang X，Zhao F，Xu C，et al.Circadian rhythm disorder of thrombosis and thrombolysis related gene expression in apolipoprotein enock－out mice［J］.Int J Mol Med，2008，22（2）：149－153.