糞便基因甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期診斷中的研究進(jìn)展

徐正，顏宏利

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200433； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200137)

結(jié)直腸癌的患病率居全世界惡性腫瘤的第三位，是第四大常見(jiàn)癌癥相關(guān)死亡原因，每年死亡病例數(shù)約70萬(wàn)[1]。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，美國(guó)結(jié)直腸癌的病死率呈下降趨勢(shì)，主要?dú)w因于不斷完善的篩查模式和先進(jìn)的治療水平；而由于飲食和生活方式的影響，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，城市高于農(nóng)村，結(jié)直腸癌患病率在男性和女性惡性腫瘤患病率中分別位于第五位和第四位，僅次于肺癌、支氣管癌、胃癌和乳腺癌[2]。臨床研究顯示，手術(shù)基本可以治愈結(jié)直腸早期異型增生息肉、腺瘤患者，但手術(shù)治療Ⅲ、Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的治愈率不足10%，臨床大多數(shù)結(jié)直腸癌患者確診時(shí)已是中晚期[3]。早期結(jié)直腸癌缺乏典型臨床癥狀，因此，尋找早期有效的結(jié)直腸癌診斷方法可降低結(jié)直腸癌患病率和相關(guān)病死率，對(duì)早發(fā)現(xiàn)、早治療、改善患者生活質(zhì)量、提高患者生存率具有重大意義。近年來(lái)，對(duì)大多數(shù)新型潛在結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的研究主要集中于糞便DNA的分析，目前確定的參與早期結(jié)直腸癌和癌前病變的3種主要遺傳機(jī)制為：①由APC、KRAS和TP53基因突變引起的染色體不穩(wěn)定性；②由錯(cuò)配修復(fù)基因功能喪失導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性；③DNA甲基化(一種表觀遺傳改變)導(dǎo)致啟動(dòng)子高甲基化并抑制隨后的基因轉(zhuǎn)錄[4]。早期對(duì)糞便DNA(KRAS等)突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的研究未取得預(yù)期的效果，近年來(lái)大多數(shù)研究集中于對(duì)糞便甲基化基因的研究?，F(xiàn)就糞便基因甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期診斷中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 篩查方法

目前，臨床篩查結(jié)直腸癌的主要手段有糞便隱血試驗(yàn)和結(jié)直腸鏡檢查。糞便隱血試驗(yàn)是早期結(jié)直腸癌篩查的簡(jiǎn)便方法，人群篩查參與率高，但其檢出癌前病變和結(jié)直腸癌的敏感性較低，需要多次重復(fù)測(cè)試，且干擾因素多，難以滿(mǎn)足臨床診斷的要求。病理檢查是確診結(jié)直腸癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有良好的診斷性能，結(jié)直腸鏡檢查有助于檢測(cè)和治療結(jié)直腸癌前病變，檢查前需要充分清潔腸道，但檢查的不適感導(dǎo)致患者依從性下降，并且操作時(shí)出現(xiàn)出血和穿孔等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)較高，難以作為早期篩查方法大規(guī)模開(kāi)展，因此臨床迫切需要尋找一種新的非侵入性的敏感性、特異性較高的結(jié)直腸癌篩查方法。

2 糞便DNA甲基化檢測(cè)

結(jié)直腸細(xì)胞更新速度較快，正常人每天結(jié)直腸脫落細(xì)胞約有1010個(gè)，與正常大腸黏膜相比，結(jié)直腸癌時(shí)大腸黏膜的脫落細(xì)胞數(shù)量更多，因此通過(guò)分析糞便脫落癌細(xì)胞和游離DNA甲基化的狀況可進(jìn)行有效的大腸癌篩查[5]。目前已知多個(gè)糞便DNA超甲基化檢測(cè)標(biāo)志物。

2.1DNA甲基化 DNA甲基化是指CpG位點(diǎn)(胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤位點(diǎn)，即DNA序列中胞嘧啶后緊連鳥(niǎo)嘌呤的位點(diǎn))在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶[6]。DNA甲基化修飾導(dǎo)致基因長(zhǎng)期處于沉默狀態(tài)，表達(dá)功能喪失，許多抑癌基因甲基化引起了腫瘤的發(fā)生、逃逸和轉(zhuǎn)移。正常人抑癌基因CpG島(人類(lèi)基因組中堿基CG序列出現(xiàn)頻率較高的區(qū)域)內(nèi)CpG序列為低甲基化狀態(tài)，而在結(jié)直腸癌腫瘤患者基因組中，啟動(dòng)子區(qū)域CpG島表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)，可抑制基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而阻斷正?；虮磉_(dá)。越來(lái)越多的研究表明，甲基化介導(dǎo)的腫瘤抑制基因沉默有助于結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[7]，結(jié)直腸癌的大量異常甲基化基因啟動(dòng)子區(qū)域具有多種生物學(xué)控制功能，如基因組穩(wěn)定性，細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)性。

2.2單基因甲基化檢測(cè)

2.2.1分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related protein，SFRP)2 SFRP是一類(lèi)分泌蛋白，可以結(jié)合Wnt配體和卷曲受體。SFPR甲基化后，Wnt信號(hào)途徑激活，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能異常，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。結(jié)直腸癌中SFRP基因甲基化可激活Wnt信號(hào)通路，并促進(jìn)細(xì)胞抵抗凋亡，Wnt信號(hào)通路的激活在整個(gè)結(jié)直腸癌進(jìn)展過(guò)程中持續(xù)存在。SFRP2是SFRP家族成員之一，可在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高度甲基化。Müller等[8]的研究指出，運(yùn)用MethyLight方法分析SFRP2基因的超甲基化可檢測(cè)出糞便樣品中SFRP2基因的高甲基化，從而診斷結(jié)直腸癌，其靈敏度和特異度分別為90%和77%，可見(jiàn)SFRP2基因檢測(cè)結(jié)直腸癌的敏感性極好。Lu等[9]運(yùn)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)檢測(cè)56例結(jié)直腸癌患者和40例健康者糞便標(biāo)本SFRP2甲基化情況，結(jié)果顯示，SFRP2基因在結(jié)直腸癌中高度甲基化57.1%(32/56)，健康對(duì)照組糞便標(biāo)本中只檢測(cè)出4例SFRP2基因甲基化，檢測(cè)的特異度為90%。Babaei等[10]的研究亦表明，SFRP2基因檢測(cè)結(jié)直腸癌的靈敏度和特異度分別為60%和92%，因此，對(duì)糞便SFRP2基因異常甲基化的檢測(cè)可能成為具有應(yīng)用前景的非侵入性結(jié)直腸癌篩查方法。

2.2.2腫瘤高甲基化1(hypermethylated in cancer 1，HIC-1)基因 HIC-1基因是一種腫瘤抑制基因，位于第17號(hào)端粒染色體區(qū)域p13.3位點(diǎn)，可調(diào)節(jié)多個(gè)正常和腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞增殖、存活和生長(zhǎng)停滯[11]。HIC-1基因可在大部分正常組織中表達(dá)，由于甲基化的影響，其在肝癌、結(jié)直腸癌等細(xì)胞的表達(dá)下降，并可在某些腫瘤的早期階段即發(fā)生甲基化，在腫瘤的發(fā)展及預(yù)后中起重要作用。Abouzeid等[12]對(duì)腫瘤抑制基因(RASSF1A、MGMT和HIC-1)在結(jié)直腸黏膜癌和癌前病變中甲基化狀態(tài)的研究顯示，潰瘍性結(jié)腸炎患者的HIC-1基因甲基化頻率最高(57.8%)。Lenhard等[13]采用MSP法對(duì)糞便標(biāo)本HIC-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行盲法分析顯示，42%的結(jié)直腸癌患者和31%的腺瘤患者的HIC-1啟動(dòng)子甲基化呈陽(yáng)性；而內(nèi)鏡下正常結(jié)腸或增生性息肉患者糞便中未檢測(cè)到甲基化HIC-1啟動(dòng)子，可見(jiàn)，表觀遺傳標(biāo)記HIC-1啟動(dòng)子甲基化具有檢測(cè)結(jié)直腸癌的潛力，可能成為結(jié)直腸腫瘤早期篩查的分子標(biāo)志物。

2.2.3波形蛋白 波形蛋白是蛋白質(zhì)中間絲家族的主要成分，在正常間質(zhì)細(xì)胞中普遍表達(dá)，可維持細(xì)胞完整性，被認(rèn)為是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。波形蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化可能有助于結(jié)直腸細(xì)胞癌變。糞便波形蛋白基因啟動(dòng)子甲基化也是敏感和特異的結(jié)直腸癌篩查指標(biāo)。Chen等[14]研究顯示，通過(guò)糞便DNA波形蛋白甲基化異常檢測(cè)結(jié)直腸癌的靈敏度為46%(95%CI35%～56%)；檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌的靈敏度為43%(26/60)(95%CI31%～57%)，僅10%(20/198)無(wú)癌個(gè)體的對(duì)照糞便DNA樣本波形蛋白甲基化檢測(cè)呈陽(yáng)性，特異度為90%(95%CI85%～94%)。Lu等[9]應(yīng)用MSP分析56例結(jié)直腸癌患者和40份結(jié)腸鏡檢查正常者糞便DNA中波形蛋白等多個(gè)基因啟動(dòng)子CpG島甲基化的研究顯示，結(jié)直腸癌患者波形蛋白基因啟動(dòng)子甲基化水平為41.1%(23/56)，該基因的特異度為85.0%(6/40)。Xiao等[15]運(yùn)用甲基化敏感性高分辨率熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌和進(jìn)展期腺瘤的波形蛋白基因甲基化狀況發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌的甲基化率為92.5%(37/40)，進(jìn)展期腺瘤的甲基化率為94.4%(34/36)，正常對(duì)照組的甲基化率為8.8%(5/57)，故認(rèn)為波形蛋白基因甲基化檢測(cè)可作為具有較好檢測(cè)性能的結(jié)直腸癌早期篩查方法。

2.2.4N-Myc下游調(diào)節(jié)基因4(N-Myc downstreem-regulated gene 4，NDRG4) NDRG4位于染色體16q21-22.1上，含有17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子，是N-myc下游調(diào)節(jié)基因家族的成員，在多種正常人體組織中高表達(dá)，在某些腫瘤組織中不表達(dá)或低表達(dá)，低表達(dá)可能與啟動(dòng)子高甲基化有關(guān)。NDRG4作為腫瘤抑制基因，其5′端調(diào)控區(qū)域含有CpG島，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中常被甲基化。Melotte等[16]應(yīng)用MSP法檢測(cè)結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照人群糞便NDRG4啟動(dòng)子甲基化的研究發(fā)現(xiàn)，糞便NDRG4啟動(dòng)子甲基化分析檢測(cè)結(jié)直腸癌的靈敏度為61%，特異度為93%。Xiao等[17]采用巢式MSP和變性高效液相色譜法成功檢測(cè)了84例結(jié)直腸癌組織、癌旁組織、糞便、血液和尿液中NDRG4基因的甲基化表達(dá)，并對(duì)甲基化NDRG4基因作為大腸癌生物標(biāo)志物的敏感性和特異性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，甲基化NDRG4基因在癌組織、癌旁組織、血液、尿液、糞便中的陽(yáng)性檢出率分別為81%、8.3%、54.8%、72.6%和76.2%；與16名年齡相仿健康對(duì)照人群相比，糞便甲基化NDRG4檢測(cè)結(jié)直腸癌的靈敏度、特異度均較高，且糞便樣本的收集較簡(jiǎn)便，故糞便甲基化NDRG4檢測(cè)有望成為結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物。

2.2.5組織因子途徑抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI-2) TFPI-2是Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員，抑制組織因子/因子Ⅶa復(fù)合物和各種絲氨酸蛋白酶，可維持腫瘤細(xì)胞環(huán)境的穩(wěn)定性、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功能[18]。腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展與TFPI-2基因CpG島的異常甲基化使TFPI-2表達(dá)降低或缺失有關(guān)。結(jié)直腸癌患者糞便TFPI-2甲基化的靈敏度和特異度較高，TFPI-2基因啟動(dòng)子檢測(cè)結(jié)直腸癌患者糞便甲基化的靈敏度和特異度分別為76%～89%和79%～93%[19-20]。

2.2.6O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT) MGMT是一種DNA修復(fù)基因，位于染色體10q26上，編碼DNA修復(fù)蛋白O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶，并可逆轉(zhuǎn)烷化劑對(duì)DNA的復(fù)制與突變的損傷。Meta分析提示，結(jié)直腸癌患者的MGMT甲基化頻率顯著上升，并且MGMT基因啟動(dòng)子的甲基化涉及結(jié)直腸癌的逐步癌變過(guò)程。Baek等[21]運(yùn)用MSP檢測(cè)糞便樣品MGMT基因甲基化狀況的研究顯示，結(jié)直腸癌的檢出率為51.7%，結(jié)直腸腺瘤的檢出率為36.5%，特異度為86.5%?？笛嗥降萚22]對(duì)糞便樣本的甲基化檢測(cè)顯示，結(jié)直腸癌、結(jié)腸腺瘤、增生性息肉的MGMT甲基化頻率分別為55.1%、37.5%、10.5%，因此，MGMT可作為結(jié)直腸癌和癌前病變的無(wú)創(chuàng)篩查分子標(biāo)志物。

此外，對(duì)結(jié)直腸癌或癌前病變患者糞便基因(硫酸類(lèi)肝素蛋白多糖2基因、分泌型卷曲相關(guān)蛋白2基因、Y染色體性別決定區(qū)域相關(guān)高遷移率族盒21基因、抑瘤素M受體基因、痙攣性截癱-20基因、GATA結(jié)合蛋白4基因、Septin9基因、p33ING1b基因等)甲基化狀態(tài)檢測(cè)的診斷效能亦較好，故也可作為篩查標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌的早期診斷[23-30]。

2.3多基因聯(lián)合檢測(cè) 結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中受到多種基因的調(diào)控，應(yīng)用單一基因診斷較局限，為了提高檢測(cè)靈敏度常對(duì)多個(gè)甲基化基因進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)。Zhang等[31]采用MSP法分析結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、增生性息肉以及健康者糞便標(biāo)本中SFRP2和WIF-1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，至少一種高甲基化基因檢測(cè)結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤的檢出率分別為81.3%(39/48)和65.7%(23/35)，其中僅1名健康者糞便樣本中檢測(cè)出高甲基化WIF-1基因，特異度為97%。肖著軍等[32]應(yīng)用MSP法檢測(cè)病例組(40例大腸癌患者、25例進(jìn)展期腺瘤患者)和正常組(30例結(jié)腸鏡陰性正常人)糞便的Vimentin和SFRP2的甲基化狀態(tài)，并與單個(gè)基因甲基化檢測(cè)的診斷性能進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩基因聯(lián)合檢測(cè)組的靈敏度(83.1%)明顯高于單純Vimentin(52.3%)以及SFRP2(67.7%)，表明在大腸癌篩查中，聯(lián)合檢測(cè)糞便Vimentin和SFRP2基因甲基化狀態(tài)優(yōu)于單個(gè)基因檢測(cè)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Ahlquist等[7]采用波形蛋白、NDRG4、BMP3和TFPI2聯(lián)合檢測(cè)篩查出85%的結(jié)直腸癌和54%的腺瘤大小≥1 cm的結(jié)直腸腺瘤患者，檢測(cè)特異度為90%，且對(duì)Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌的檢出率為87%。Imperiale等[33]對(duì)9 989名參與者運(yùn)用多靶點(diǎn)DNA測(cè)試板(包括KRAS突變，NDRG4、BMP3基因甲基化、β-肌動(dòng)蛋白以及血紅蛋白免疫測(cè)定)進(jìn)行評(píng)估，鑒定出結(jié)直腸癌患者65例(0.7%)，晚期癌前病變(晚期腺瘤或無(wú)柄鋸齒狀息肉，最大病灶直徑≥1 cm)患者757例(7.6%)。 糞便DNA檢測(cè)檢出結(jié)直腸癌的靈敏度為92.3%，檢出晚期癌前病變的靈敏度為42.4%，檢出高級(jí)別不典型增生息肉的靈敏度為69.2%，DNA檢測(cè)的特異度為86.6%?；贗mperiale[33]的研究，美國(guó)食品藥物管理局在2014年批準(zhǔn)了Cologuard?試劑(Exact Sciences Corporation，Madison，WI，美國(guó))用于結(jié)直腸癌的早期篩查，由此可見(jiàn)，聯(lián)合檢測(cè)較單基因檢測(cè)及其他糞便檢測(cè)的診斷效能更高。DNA高甲基化與結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，對(duì)新的具有潛力的甲基化基因SLC6A15、NPY、GRASP、ST8SIA1和ZSCAN18、MAPK14、MAPK3、HRAS、YY1、IRF4的研究正在進(jìn)行中[34-35]。

3 現(xiàn)狀以及存在的問(wèn)題

目前，血漿Septin9基因甲基化檢測(cè)商業(yè)試劑盒已應(yīng)用于結(jié)直腸癌臨床輔助診斷，新的具有潛力的甲基化基因SLC6A15、NPY、GRASP、ST8SIA1和ZSCAN18、MAPK14、MAPK3、HRAS、YY1、IRF4的研究也在進(jìn)行中[34-35]?；诩S便基因甲基化檢測(cè)的標(biāo)志物還面臨以下主要問(wèn)題：①缺乏理想的糞便DNA甲基化基因。與結(jié)直腸癌相關(guān)的甲基化基因較多，單個(gè)或多個(gè)基因組合診斷結(jié)直腸癌和晚期結(jié)直腸腺瘤的靈敏度和特異度不一，尋找靈敏度和特異度較高的單個(gè)或復(fù)合的甲基化基因是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。②直接提取糞便DNA時(shí)，易造成細(xì)菌等其他DNA污染以及DNA提取量不足的情況，需要?jiǎng)?chuàng)新糞便脫落細(xì)胞分離技術(shù)，建立簡(jiǎn)便、標(biāo)準(zhǔn)化、特異性高的腫瘤細(xì)胞分離收集方法，以提高檢測(cè)的敏感性和特異性。③需要改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化甲基化檢測(cè)方法的靈敏度。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者糞便中單基因甲基化檢測(cè)的敏感性存在偏倚，可能與研究對(duì)象的種族、性別、樣本數(shù)量以及甲基化檢測(cè)方法的不同有關(guān)[36]。④不典型增生性腺瘤是最常見(jiàn)的結(jié)直腸癌癌前病變，其發(fā)展為結(jié)直腸癌的病程往往在10年以上，可見(jiàn)不典型增生性腺瘤的早期檢測(cè)十分重要，但目前研究仍集中于對(duì)惡性腫瘤敏感的標(biāo)志物，開(kāi)發(fā)更多對(duì)癌前腺瘤組織敏感和特異的甲基化指標(biāo)是未來(lái)的研究方向和研究重點(diǎn)。

4 小 結(jié)

從結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程來(lái)看，由不典型增生性結(jié)直腸息肉發(fā)展到惡性結(jié)直腸腺癌是遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變共同作用積累的過(guò)程，存在多種癌基因激活和抑癌基因失活的參與，其中基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化可導(dǎo)致抑癌基因失活，且在腫瘤發(fā)生早期已出現(xiàn)，故抑癌基因甲基化檢測(cè)有助于結(jié)直腸癌的早期診斷以及腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的評(píng)估，對(duì)指導(dǎo)臨床診療工作具有重要意義。糞便脫落細(xì)胞DNA甲基化檢測(cè)作為全新的無(wú)創(chuàng)篩查模式對(duì)診斷結(jié)直腸癌、評(píng)估患者預(yù)后、監(jiān)測(cè)病情發(fā)展等具有潛在價(jià)值。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展及分子生物學(xué)研究的深入，糞便DNA甲基化檢測(cè)在癌前病變監(jiān)測(cè)和結(jié)直腸癌早期診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景，將成為結(jié)直腸癌早期診斷、早期治療和預(yù)后判斷的新型標(biāo)志物。