多肽類藥物的氨基酸檢測(cè)方法

王麗莉

摘 要：多肽類藥物的氨基酸組分測(cè)定步驟：多肽的水解方法→衍生→HPLC檢測(cè)。簡(jiǎn)述多肽藥物的水解方式及衍生方法。

關(guān)鍵詞：氨基酸組分；柱前衍生法；多肽藥物

多肽類藥物是由20種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵、二硫鍵連接成一長(zhǎng)鏈或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，常具備α螺旋、β折疊或不規(guī)則卷曲的二級(jí)結(jié)構(gòu)。多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了藥物的高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能。分析多肽類藥物的氨基酸組成是進(jìn)行多肽類藥物結(jié)構(gòu)確證不可缺少的部分。氨基酸組成分析的步驟：多肽的水解方法→衍生→HPLC檢測(cè)。

1 多肽的水解方法

雖然多肽的氨基酸組成分析方法較多，且趨向更靈敏、更精確、更簡(jiǎn)便、更快速，但還沒有一種方法可以單獨(dú)適用于所有氨基酸殘基的檢測(cè)，并且很多因素如溫度、時(shí)間、水解試劑、水解方法及多肽樣品中添加劑等對(duì)水解程度均有影響。常用的水解方法作簡(jiǎn)要介紹如下：

1.1 酸性水解[1]

酸性水解是應(yīng)用最為廣泛水解方法，可以使大多數(shù)氨基酸殘基完全水解，最通用的水解劑是6 mol/L HCl。

條件：6 mol/L HCl、真空、110℃，水解時(shí)間為20～24h。即可用于液相水解模式也可用于氣相水解模式。但在該條件下，天冬酰胺和谷氨酰胺分別被完全水解為天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸則被完全破壞，半胱氨酸先用二硫代二丙酸、4-乙烯吡啶或碘代乙酸保護(hù)后水解方可測(cè)定，酪氨酸部分被水解液所破壞，絲氨酸和蘇氨酸被部分水解。有些脂肪族氨基酸殘基間的肽鍵難于裂解，可以通過延長(zhǎng)水解時(shí)間如水解92h甚至120h來解決。

1.2 堿性水解

堿性水解一般選用NaOH和KOH作為水解劑。該水解方法是HCl水解的互補(bǔ)法。因?yàn)閴A水解時(shí)，多數(shù)氨基酸遭到破壞或外消旋化，僅色氨酸是穩(wěn)定的。所以此法僅限于測(cè)定色氨酸。

1.3 酶水解

用一組蛋白酶水解肽鏈，特別適用于對(duì)化學(xué)水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的測(cè)定。水解過程中氨基酸不發(fā)生消旋化，幾乎可以保持所有的組成氨基酸不被破壞。但是因?yàn)槊杆鈼l件溫和，對(duì)天冬酰胺、谷氨酰胺等皆無破壞作用，且反應(yīng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，水解不完全，酶本身也是蛋白質(zhì)，對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果可能會(huì)有干擾。

微波輻射能水解，一般情況下190℃微波水解15分鐘肽類即可完全水解，導(dǎo)致完全水解的時(shí)間大大縮短。在微波輔助酸水解和微波輔助酶水解中，水解時(shí)間可從過去的幾十小時(shí)縮短到幾十分鐘。

總之，多肽藥物水解方式應(yīng)根據(jù)其產(chǎn)品的性質(zhì)、研究目的、可獲得的樣品量及少實(shí)驗(yàn)室的具體條件采取適宜的水解方法。

2 衍生

從衍生角度看，氨基酸分析可以分為柱后反應(yīng)法和柱前衍生法兩大類。

目前肽類的氨基酸衍生主要以柱前衍生為主。將游離氨基酸經(jīng)過色譜柱分離后，各種氨基酸再與顯色劑（茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛）作用。此法比較穩(wěn)定，對(duì)樣品預(yù)處理要求低，容易定量和自動(dòng)化操作，但檢測(cè)靈敏度不高，分析時(shí)間長(zhǎng)。

2.1 柱前衍生法

將氨基酸和化學(xué)偶聯(lián)試劑先反應(yīng)生成氨基酸的衍生物，然后再用色譜柱將各種衍生物分離，直接檢測(cè)衍生物的光吸收或熒光發(fā)射。此法可檢測(cè)OPA-（鄰苯二甲醛），F(xiàn)MOC，PITC，AQC，DNFB，Dansyl-氨基酸，分析靈敏度高，可利用HPLC進(jìn)行氨基酸分析，有的衍生物不穩(wěn)定，衍生試劑可能干擾氨基酸檢測(cè)。

多肽藥物的氨基酸組分分析大多數(shù)采用柱前衍生。

2.2 PITC柱前衍生氨基酸分析法[2]

本法系根據(jù)氨基酸與異硫氰酸苯酯（PITC）反應(yīng)，生成有紫外響應(yīng)的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經(jīng)反相高效液相色譜分離后用紫外檢測(cè)，在一定的范圍內(nèi)其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～1.25？滋mol/ml，本法檢驗(yàn)操作比較復(fù)雜。

2.3 AQC柱前衍生分析法

本法系根據(jù)氨基酸與6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯（AQC）反應(yīng)，生成有紫外與熒光響應(yīng)的不對(duì)稱尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸經(jīng)反相高效液相色譜后用紫外或熒光檢測(cè)，在一定的范圍內(nèi)其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為2.5～200nmol/ml。

2.4 OPA和FMOC柱前衍生氨基酸分析法

一級(jí)氨基酸與鄰苯二醛（OPA）反應(yīng)，生成在338nm波長(zhǎng)下有吸收的OPA-氨基酸；二級(jí)氨基酸與FMOC反應(yīng)，生成在262nm波長(zhǎng)下有吸收的FMOC-氨基酸，生成的氨基酸衍生物通過高效液相色譜分離后用紫外或熒光檢測(cè)。

2.5 DNFB柱前衍生氨基酸分析法

本法系根據(jù)氨基酸與2，4-二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)，生成有紫外響應(yīng)的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸經(jīng)反相高效液相色譜分離后采用紫外檢測(cè)，在一定的范圍內(nèi)其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應(yīng)范圍為30～140 pmol。除另有規(guī)定外，一般不宜采用本法。

2.6 Dansyl-Cl（DNS-Cl）法

熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）能與所有氨基酸柱前反應(yīng)形成高穩(wěn)定性的帶有熒光的DNS-氨基酸。但反應(yīng)耗時(shí)。

3 結(jié)束語

總之，肽類的氨基酸測(cè)定可以采用不同的水解方式，采用適宜的衍生方法經(jīng)行測(cè)定，另外隨著質(zhì)譜技術(shù)的廣泛應(yīng)用，可以采用質(zhì)譜法測(cè)定肽類物質(zhì)的氨基酸序列，不但可以判定肽類的氨基酸組成還可判定其氨基酸的鏈接順序，使肽類氨基酸的檢測(cè)更準(zhǔn)確，對(duì)肽類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證更具意義。

參考文獻(xiàn)

[1]趙成仕，臧愛香，夏蓮.酸水解-全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定蜂蜜中17種氨基酸[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013年03期.

[2]呂瑩果，張暉，孟祥勇.氨基酸測(cè)定及衍生方法[J].糧食與油脂，2009年第07期.