養(yǎng)正消積膠囊對(duì)CaEs-17細(xì)胞成瘤組織及對(duì)荷瘤裸鼠生存狀態(tài)與白細(xì)胞分類的影響

符文明張愛琴范麗萍彭進(jìn)文

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科 杭州 310005 2浙江省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科

養(yǎng)正消積膠囊對(duì)CaEs-17細(xì)胞成瘤組織及對(duì)荷瘤裸鼠生存狀態(tài)與白細(xì)胞分類的影響

符文明1張愛琴2范麗萍1彭進(jìn)文1

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科 杭州 310005 2浙江省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科

目的 探討?zhàn)B正消積膠囊對(duì)荷瘤裸鼠食管鱗癌的抑制作用及對(duì)其生存狀態(tài)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類的影響。方法 食管鱗癌CaEs-17細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)并接種于裸鼠皮下，隨機(jī)分組后給予低、中、高劑量的養(yǎng)正消積溶液灌胃，并與順鉑對(duì)照。觀察荷瘤裸鼠生存狀況，測(cè)量腫瘤抑制率，檢測(cè)裸鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類。結(jié)果 養(yǎng)正消積膠囊對(duì)荷瘤裸鼠食管癌組織具有抑制作用，對(duì)其日常生活質(zhì)量、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量具有維持作用，與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 養(yǎng)正消積膠囊能抑制荷瘤裸鼠食管癌組織增殖，有利于改善其生存狀態(tài)與白細(xì)胞水平。

裸鼠；食管癌；養(yǎng)正消積膠囊；腫瘤抑制率；白細(xì)胞分類

圖1 模型組（HE×200）

圖2 順鉑組（15mg/kg）（HE×200）

圖3 養(yǎng)正消積低劑量組（1mg/kg）（HE×200）

圖4 養(yǎng)正消積中劑量組（2mg/kg）（HE×200）

圖5 養(yǎng)正消積高劑量組（4mg/kg）（HE×200）

養(yǎng)正消積膠囊作為抗癌新藥，目前對(duì)食管癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚無報(bào)道。我們采用食管癌CaEs-17細(xì)胞株培養(yǎng)并接種于BALB/c裸鼠皮下造模，通過測(cè)量腫瘤抑制率，觀察裸鼠生存狀況，檢測(cè)裸鼠白細(xì)胞分類，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)正消積膠囊對(duì)食管癌組織具有增殖抑制作用，有利于改善荷瘤裸鼠生存質(zhì)量，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 健康BALB/c雄性裸鼠54只，體質(zhì)量18～22g，購自上海西普爾·必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：2008001630244。CaEs-17細(xì)胞，購自中科院上海細(xì)胞研究所。

1.2 藥 物 養(yǎng)正消積膠囊藥粉（規(guī)格：0.39g/粒），由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司饋贈(zèng)。順鉑（批號(hào)WA2A1209056，規(guī)格：20mg/支），購自齊魯制藥有限公司。

1.3 試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶，購自Gibico公司。劉A液、劉B液，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。蘇木精、伊紅，購自上海善普科技有限公司。Coulter LH750全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀,購自美國貝克曼庫爾特公司。光學(xué)顯微鏡，購自日本Olympus公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與造模 從液氮中取出含CaEs-17細(xì)胞株凍存管，37℃水浴中快速解凍后移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。將解凍的細(xì)胞懸液加入含有10mLD-Hanks液的離心管內(nèi)，1000rpm離心5min后，移去上清液，加入RPMI 1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清，100U/ mL青霉素、100U/mL鏈霉素）混合均勻后，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的CaEs-17細(xì)胞，用2mL 0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸消化后，收集細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1× 107/mL細(xì)胞。全部54只裸鼠用隨機(jī)數(shù)字逐個(gè)編號(hào)，選數(shù)字最小者8只作為正常組；其余46只裸鼠按每只0.2mL標(biāo)準(zhǔn)接種CaEs-17細(xì)胞懸液于右腋皮下。接種后第7天，對(duì)接種裸鼠按序編號(hào)，每天用卡尺測(cè)量腫瘤組織的最長徑L（mm）和垂直方向的最大橫徑W（mm）1次以計(jì)算腫瘤體積V（mm3）（=L×W2/2）。第10天腫瘤體積增至100～270mm3左右。

2.2 分 組 按腫瘤體積將裸鼠分為大（201～270mm3）、中（100～200mm3）、?。ǎ?00mm3）三組，其中腫瘤體積最小的1只，用頸椎脫臼法處死；腫瘤體積大的5只和中的40只用隨機(jī)數(shù)字分別編號(hào)后根據(jù)數(shù)字由小到大依次分成模型組、順鉑組和養(yǎng)正消積膠囊低、中、高劑量組，每組9只。分組次日，除模型組外，另四組分別予以順鉑腹腔注射、養(yǎng)正消積膠囊灌胃處理。全部裸鼠均在SPF環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)。

2.3 給 藥 養(yǎng)正消積膠囊每粒重0.39g，成人用量為每次4粒，每天3次。按《中藥藥理研究方法學(xué)》中用量折算方法，以成人用量折算成裸鼠低劑量組，得出養(yǎng)正消積低、中、高劑量組裸鼠每天生藥用量分別為0.02、0.04和0.08g。用生理鹽水調(diào)濃度為0.05、0.1和0.2g/mL，使每只裸鼠每天灌胃養(yǎng)正消積懸液用量均為0.4mL；順鉑組將20mg順鉑溶解入20mL生理鹽水中，隔日裸鼠腹腔注射0.3mL；模型組與正常組裸鼠飼養(yǎng)過程中不給任何藥物。給藥時(shí)間為30天。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法 ①各組裸鼠的精神、活動(dòng)、飲食、皮色、排便及死亡情況。并在首次及末次給藥當(dāng)天各稱重1次；②末次給藥后第3天，頸椎脫臼法處死全部裸鼠并完整剝?nèi)∧[瘤組織，用電子天平稱腫瘤重量并計(jì)算抑瘤率[=（模型組平均重量-治療組平均重量）/模型組平均重量×100%]；摘眼球采血法采集每組裸鼠血液送化驗(yàn)室進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)；從每個(gè)血標(biāo)本中取一滴血液，編號(hào)后做血液涂片及白細(xì)胞分類。血涂片制作法：劉A液（主要含曙紅、甲醇）約0.8mL滴在血液涂片上染色30s后加劉B液（主要含亞甲藍(lán)）于劉A液上，吹耳球吹液使混和充分。2min后，自來水沖去染色液。待涂片干燥后，200倍光學(xué)顯微鏡拍照，1000倍油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)血細(xì)胞，找出中性粒細(xì)胞（N）、淋巴細(xì)胞（L）與單核細(xì)胞（M），并換算成百分比；③各組腫瘤組織編號(hào)后予以福爾馬林固定、石蠟包埋、切片并按說明書進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE染色），200倍光鏡下拍照。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多個(gè)樣本之間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大體觀察與病理結(jié)果 正常組裸鼠精神飽滿，活動(dòng)正常，皮色光澤，飲食正常，排便未見異常，未見死亡。模型組裸鼠隨著腫瘤體積增大，飲食量增大，排便未見異常，日?；顒?dòng)量有所減少、精神狀態(tài)未見異常，皮色光澤，身體偏胖。順鉑組裸鼠隨著腫瘤體積增大，精神狀態(tài)明顯下降，飲食量減少，皮膚菲薄，干燥起皺，身體消瘦，其中1只死于無法進(jìn)食。養(yǎng)正消積低、中、高劑量組裸鼠隨著腫瘤體積增大，仍精神飽滿，日?；顒?dòng)、飲食、排便、皮色無異常改變。低劑量組裸鼠因打架死亡1只。各組裸鼠移植瘤組織病理結(jié)果見圖1～5（插頁）。

3.2 各組裸鼠平均體質(zhì)量比較 給藥前順鉑組與其余各組裸鼠平均體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥后順鉑組裸鼠平均體質(zhì)量顯著低于其余各組（P均＜0.01）。見表1。

表1 各組裸鼠平均體質(zhì)量比較（±s）

表1 各組裸鼠平均體質(zhì)量比較（±s）

注：與順鉑組比較，*P＜0.01

組別正常組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組n/只 劑量/（mg/kg） 平均體質(zhì)量/g 898899 --1 5124給藥前23.94±1.85 23.64±1.69 23.52±1.51 23.47±1.62 23.21±1.25 23.36±1.42給藥后26.89±2.78* 27.16±1.62* 18.66±1.66 25.23±2.42* 25.80±1.46* 25.63±2.39*

3.3 各組裸鼠平均瘤重及抑瘤率比較 與模型組比較，各給藥組平均瘤重明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；以40%為標(biāo)準(zhǔn)，抑瘤率以順鉑組最高，其次為養(yǎng)正消積低劑量組，養(yǎng)正消積中、高劑量組未達(dá)標(biāo)。見表2。

表2 各組裸鼠平均瘤重及抑瘤率比較（±s）

表2 各組裸鼠平均瘤重及抑瘤率比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

瘤率/% --50.76 40.39 26.78 24.83

3.4 各組裸鼠血白細(xì)胞總數(shù)及分類比較 與模型組比較，養(yǎng)正消積低劑量組血白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、單核細(xì)胞（M）百分比明顯增高（P＜0.05，P＜0.01），順鉑組中性粒細(xì)胞（N）百分比增高，淋巴細(xì)胞（L）百分比降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，養(yǎng)正消積低、中、高劑量組中性粒細(xì)胞（N）百分比降低（P＜0.01），淋巴細(xì)胞（L）百分比增高（P＜0.01），見表3。

表3 各組裸鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類比較（±s）

表3 各組裸鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與順鉑組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組n/只898899 WBC/×109/L 6.32±1.32 7.46±1.42 8.18±0.90 9.36±2.23△8.34±2.12 9.74±1.43△N/% 50.0±11.11 67.0±14.76 79.8±4.76△△58.8±4.15** 62.8±4.87** 59.8±8.14** L/% 43.80±14.13 25.40±15.71 11.4±4.83△△27.6±3.78** 27.6±9.34** 28.2±6.87** M/% 4.2±3.77 5.8±3.19 8.8±5.81 13.6±1.82△△* 9.6±6.35 12.0±3.16△*

4 討論

目前食管癌的最佳化療方案與最佳劑量仍不明確。但一般認(rèn)為，順鉑的療效比較確切[1-2]。養(yǎng)正消積膠囊為抗癌中成藥，由黃芪、女貞子、莪術(shù)、人參、白術(shù)、靈芝、絞股藍(lán)、土鱉蟲、半枝蓮、蛇舌草、白英、蛇莓、茵陳、徐長卿、雞內(nèi)金組成。方中黃芪、人參、靈芝、女貞子、絞股藍(lán)，健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)陰以扶正，使脾腎功能健旺，發(fā)揮“養(yǎng)正積自消”之功；土鱉蟲、莪術(shù)逐瘀散結(jié)通絡(luò)；半枝蓮、蛇舌草、白英、蛇莓解毒抗癌以攻邪；徐長卿通絡(luò)止痛，雞內(nèi)金健胃消積，茵陳舒暢氣機(jī)。養(yǎng)正消積膠囊的組方原則與中醫(yī)對(duì)該病的治療方法[3]基本一致。

藥物的抗癌作用是通過抑瘤率來衡量的，根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》，抑瘤率以＞40%為有效[4]。HE染色結(jié)果表明，各組裸鼠組織細(xì)胞符合惡性腫瘤細(xì)胞特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，順鉑和養(yǎng)正消積膠囊均具有抑制腫瘤組織增殖的作用，以順鉑效果最佳。隨著養(yǎng)正消積膠囊劑量的加大，抑瘤率反而下降，此現(xiàn)象說明養(yǎng)正消積膠囊不存在劑量療效的線性關(guān)系。

癌癥的治療應(yīng)重視患者的生存質(zhì)量。通過觀察不同給藥方法對(duì)荷瘤裸鼠生活狀況及體質(zhì)量的影響，可見順鉑組裸鼠生存質(zhì)量較差，體質(zhì)量下降明顯（P＜0.01），并出現(xiàn)裸鼠無法進(jìn)食而死亡現(xiàn)象，而養(yǎng)正消積膠囊各組則無此現(xiàn)象。

順鉑存在骨髓抑制，胃腸道反應(yīng)等副作用。而維持一定數(shù)量的白細(xì)胞對(duì)機(jī)體防御感染、消除腫瘤細(xì)胞甚至治愈腫瘤具有重要意義[5]。本研究結(jié)果顯示，順鉑有升高中性細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）并降低淋巴細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）的作用，而養(yǎng)正消積膠囊則有維持中性細(xì)胞與淋巴細(xì)胞數(shù)的作用，高、低劑量養(yǎng)正消積膠囊尚能增加單核細(xì)胞數(shù)（P＜0.01）；與順鉑組相比，養(yǎng)正消積膠囊在降低中性細(xì)胞、升高淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞數(shù)上存在明顯優(yōu)勢(shì)（P＜0.01或P＜0.05）。這有利于維持機(jī)體的固有免疫力，有利于荷瘤裸鼠的生存。

中醫(yī)十分強(qiáng)調(diào)正氣在疾病治療中的作用，認(rèn)為攻邪不能傷正，扶正也能消積。養(yǎng)正消積膠囊主要由扶正與攻邪兩類藥物組成，方中半枝蓮、白花蛇舌草、白英、蛇莓為苦寒之品，劑量倍增，更損傷正氣，反而影響總體療效。這一現(xiàn)象提示我們，對(duì)苦寒傷正中藥的運(yùn)用應(yīng)把握有度。過度化療有害，中藥過度“抗癌”也可能無益，正氣受損最終會(huì)影響抗癌療效。

［1］孫燕，石遠(yuǎn)凱.臨床腫瘤內(nèi)科手冊(cè)［M］.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：470.

［2］Bleiberg H，Conroy T，Paillot B，et al.Randomised phase two study of Cisplatin and 5-Flurouracil versus Cisplatin alone in advanced squamous cell oesophageal cancer［J］.Eur J Cancer 1997，33（8）：1216-1220.

［3］王永炎，麟兆麟.中醫(yī)藥學(xué)高級(jí)叢書·中醫(yī)內(nèi)科學(xué)［M］.第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：428-429.

［4］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：1235.

［5］金伯泉，熊思東.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：215.

修回日期：2014-09-03

Effect of Yangzheng Xiaoji Capsules on Esophageal Carcinoma CaEs-17 Cell Tissues and the Survival Condition and White Blood Cell Classification of Mice

FU Wenming1,ZHANG Aiqin2,FAN Liping1,PENG Jinwen1. 1.Department of Traditional Chinese Medicine,the Second Hospital affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2.Zhejiang Cancer Hospital.

Objective To investigate the inhibitory effect of Yangzheng Xiaoji capsules on esophageal squamous cell carcinoma and its effect on the condition of survival and white blood cell（WBC）classification of rats.Methods Esophageal carcinoma CaEs-17 cells were cultivated and subcutaneously inoculated in nude mice.Mice with esophageal carcinoma were randomized into three Yangzheng Xiaoji capsule groups with different dosages（low, medium,and high）and one cisplatin group as control.The survival condition of tumor-burdened nude mice were observed.The inhibition rate of tumor was calculated.The number of WBC was determined.Results Yangzheng Xiaoji capsules inhibited the growth of esophageal carcinoma tissues of mice,and consequently improved the survival condition of mice.The number of WBC and lymphocytes in Yangzheng Xiaoji capsule groups were significantly different with that in cisplatin group（P＜0.05）.Conclusion Yangzheng Xiaoji capsules has inhibitory effect on growth of esophageal carcinoma tissues,resulting in improvement of quality of survival and keeping normal number of WBC and lymphocytes.

Nude mice；esophageal carcinoma；Yangzheng Xiaoji capsules；tumor inhibition rate；WBC classification

2014-06-02