燈盞花素對膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷保護作用的實驗研究

楊 梅 張艷杰 朱海萍 王 丹 王曉蓉 高秋琦 李卓英 潘景業(yè)

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科 溫州 325000

燈盞花素對膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷保護作用的實驗研究

楊 梅 張艷杰 朱海萍 王 丹 王曉蓉 高秋琦 李卓英 潘景業(yè)

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科 溫州 325000

目的 觀察燈盞花素對膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷的保護作用。方法 清潔級Wistar雄性大鼠60只，隨機分為假手術組、膿毒血癥模型組和燈盞花素大、中、小劑量組，每組12只。采用盲腸結扎穿孔術（CLP）復制大鼠膿毒血癥模型。燈盞花大、中、小劑量組在造模后立即分別給予燈盞花素5、10、20mg/kg尾靜脈注射。術后24h處死大鼠，下腔靜脈取血測定肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）水平，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）、腎損傷分子1（KIM-1）的水平；摘取腎組織標本進行病理組織學觀察，免疫印跡法檢測腎臟NGAL和KIM-1蛋白含量。結果 與膿毒血癥組比較，燈盞花素大、中劑量組大鼠血清Scr、BUN、NGAL和KIM-1水平及腎組織NGAL和KIM-1蛋白表達水平均顯著降低（P均＜0.05）；腎臟病理改變好轉。燈盞花素小劑量組腎臟病理改變未見好轉（P＞0.05）。結論 燈盞花素可以顯著改善膿毒血癥模型大鼠腎組織損傷，降低血清NGAL和KIM-1水平及腎組織NGAL和KIM-1蛋白表達量，對膿毒血癥所致急性腎損傷具有保護作用。

大鼠；感染性休克；膿毒血癥；急性腎損傷；燈盞花素；NGAL；腎損傷分子1

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是由多種病因引起的短時間內(nèi)（幾個小時或幾天）腎功能突然下降而出現(xiàn)的臨床綜合征。嚴重感染和感染性休克是AKI最常見發(fā)病原因之一，約占急性腎功能衰竭（acute renal failure，ARF）的50%[1]。AKI發(fā)生后，又會促進和加重其它臟器的損傷，導致MODS（多器官功能障礙綜合征），增加死亡率。嚴重感染的患者并發(fā)ARF的病死率高達70%，明顯高于其它原因所致ARF的病死率[2]。燈盞花素是燈盞花中提取而來，其有效成分是總黃酮[3]，主要為燈盞乙素，也含有少量燈盞甲素。具有擴張血管、降低血液黏滯度、改善微循環(huán)、防治血栓形成的作用，在心腦血管疾病治療中已應用多年。本研究通過建立膿毒血癥大鼠模型，給予燈盞花素干預，觀察其對膿毒血癥急性腎損傷的保護作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 6周齡清潔級雄性Wistar大鼠，60只，體質量225g左右，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供和飼養(yǎng)，許可證號：SCXK（溫）2013-0023。所有大鼠手術前3d單獨放入代謝籠內(nèi)，給予標準規(guī)格的嚙齒類食物喂養(yǎng)，可自由飲水。喂養(yǎng)環(huán)境設置：12h∶12h人工白天黑夜循環(huán)，室內(nèi)溫度維持在（21±2）℃，濕度維持在（55±2）%。

1.2 藥 物 燈盞花素注射液（規(guī)格：20mg/5mL，純度＞95%，神威藥業(yè)有限公司贈送，批號Z13020778）。

1.3 試 劑 尿素氮（BUN）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20130509）；肌酐（Cr）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20130412）；中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）檢測試劑盒（北京博奧森生物有限公司，批號20130510）；腎損傷分子（kidney injury molecule-1，KIM-1）檢測試劑盒（北京博奧森生物有限公司，批號20130301）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司，批號Pierce23225，NO.126）；兔抗大鼠NGAL多克隆抗體（武漢博士德公司，BA3435）；兔抗大鼠KIM-1多克隆抗體（武漢博士德公司，批號BA3537）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組 大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分成假手術組、膿毒血癥模型組和燈盞花素大、中、小劑量組，每組12只。燈盞花素大、中、小劑量組分別于術前及術后給予燈盞花素0.28、0.56、1.12mL尾靜脈注射；假手術組及模型組術前及術后用0.5mL生理鹽水靜脈注射。實驗前禁食過夜，自由飲水。大鼠予0.3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉，常規(guī)腹部碘伏消毒，備皮和鋪無菌紗布洞巾。沿腹中線切開腹壁皮膚約1cm，用無菌鑷探查到盲腸后用手術縫線結扎盲腸（避免結扎回腸及盲腸系膜血管），20G無菌針頭分別于被結扎盲腸頭尾端穿孔，然后擠壓盲

2.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠血清Cr、BUN水平比較 術后24h，膿毒血癥組大鼠Scr、BUN含量顯著高于假手術組（P＜0.05）。大、中、小劑量燈盞花素治療后，大鼠Scr、BUN含量明顯下降，但仍然高于假手術組（P均＜0.05）；燈盞花素大、中劑量組大鼠Scr、BUN含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與膿毒血癥組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；小劑量組與膿毒血癥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

3.2 各組大鼠血清NGAL和KIM-1水平比較 與假手術組比較，膿毒血癥組大鼠血清NGAL和KIM-1水平顯著升高（P均＜0.05）；與膿毒血癥組比較，燈腸，使其內(nèi)容物沿穿孔部位擠出0.3mL，將盲腸和擠出內(nèi)容物一起送回腹腔，逐層縫合腹壁切口。假手術組動物只進行相同的操作，不進行盲腸結扎和穿孔。

2.2 標本采集及檢測 術后24h處死大鼠，收集尿液、采血、解剖腎臟去除包膜、稱重、取一半腎臟組織做光鏡標本，余腎組織置于凍存管中放液氮保存。

2.2.1 血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）測定 血標本常溫下放置1h，3000r/min分離血清，-20℃凍存待測。采用全自動多功能生化分析儀嚴格按照試劑盒要求進行測定。

2.2.2 腎臟病理組織學觀察 取腎組織置10%甲醛固定后石蠟包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。

2.2.3 腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白測定 勻漿器充分研磨、勻漿腎臟髓質組織，RIRA細胞裂解液裂解，在冰上放置 30min，4℃、14 000r/min離心15min，棄沉淀，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白質總量為30μg的蛋白，在12%的聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠上電泳，電壓150V、約70min，在4℃、250mA電流1.5h轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入山羊抗大鼠NGAL和KIM-1抗體，4℃過夜，去一抗，TBST緩沖液洗3次，每次10min，再加入相應辣根過氧化物酶標記的第二抗體，室溫孵育1.5h，ECL試劑顯色并曝光成像，掃描圖像。采用Quantity One V6.42軟件分析各條帶灰度值，將各目的條帶灰度值與同一標本內(nèi)參照β-肌動蛋白條帶灰度值的比值作為該目的蛋白的半定量結果。盞花素大、中劑量組NGAL和KIM-1水平明顯降低（P均＜0.05），小劑量組NGAL和KIM-1水平與膿毒血癥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮、NGAL、KIM-1水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮、NGAL、KIM-1水平比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與膿毒血癥組比較，△P＜0.05

組別假手術組膿毒血癥組燈盞花素大劑量組燈盞花素中劑量組燈盞花素小劑量組n/只12 12 12 12 12肌酐/（μmol/L）34.03±3.26 54.70±5.02* 37.46±4.39*△39.49±4.28*△53.78±4.99*尿素氮/（mmol/L）8.59±0.90 26.85±4.90* 13.92±2.66*△14.15±2.71*△24.12±4.64* NGAL/（ng/mL）4.24±0.52 7.90±0.83* 5.13±0.59*△5.15±0.57*△7.88±0.81* KIM-1/（ng/L）21.76±3.59 100.30±13.28* 54.23±6.92*△53.76±6.67*△96.42±14.19*

3.3 腎臟組織病理改變 膿毒血癥組大鼠腎小球皺縮明顯，腎組織彌漫嗜中性粒細胞浸潤，組織間隙水腫明顯，球囊擴張，腎小管上皮部分管型形成，細胞空泡變性、腫脹，腎小管腔閉塞，腎小管囊腔擴張，管型形成。盞花素大、中劑量組單核—巨噬細胞浸潤較膿毒血癥組減輕，腎小管呈灶狀損害，部分腎小管上皮濁腫、空泡變性，組織間隙水腫減輕；小劑量組與膿毒血癥組病理損傷無顯著差異，見圖1（封三）。

3.4 各組大鼠腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達量比較 與假手術組比較，膿毒血癥組大鼠腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達顯著升高（P均＜0.05）；與膿毒血癥組比較，燈盞花素大、中劑量組腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達水平明顯降低（P均＜0.05），而小劑量組腎臟組織中NGAL和KIM-1蛋白表達水平與膿毒血癥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2（封三），表2。

表2 各組大鼠腎組織NGAL、KIM-1表達量比較（±s）

表2 各組大鼠腎組織NGAL、KIM-1表達量比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與膿毒血癥組比較，△P＜0.05

組別假手術組膿毒血癥組燈盞花素大劑量組燈盞花素中劑量組燈盞花素小劑量組n/只12 12 12 12 12 NGAL/（ng/mL）0.57±0.06 1.33±0.11* 0.68±0.06*△0.67±0.05*△1.29±0.12* KIM-1/（ng/L）0.11±0.01 0.56±0.06* 0.10±0.01*△0.10±0.02*△0.55±0.05*

4 討論

全身感染導致AKI的發(fā)病率約占全部AKI的一半[1]。嚴重感染患者并發(fā)急性腎功能衰竭的病死率高達70%[4-5]，國內(nèi)研究中嚴重感染患者并發(fā)急性腎功衰竭的病死率甚至高達近80%[6]。目前全球范圍內(nèi)對膿毒血癥休克的早期治療方法不斷涌現(xiàn)，如早期目標指導治療、強化血糖控制、應激劑量激素治療、活性蛋白C的應用及集束化治療等等[7]，但臨床上尚沒有能夠有效防治AKI和縮短自然病程的措施和方法。

藥理研究證實，燈盞花素是一種較強的活血化瘀藥物，可抑制血小板聚集，抑制內(nèi)凝血及促進纖維蛋白原溶解，降低血黏度，改善高凝狀態(tài)和血管痙攣[8]；通過改善腎臟微循環(huán)而抑制腎小球系膜增殖和腎小球局灶硬化[9]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)燈盞花素可減輕輸尿管梗阻大鼠腎臟間質纖維化[10]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥組大鼠出現(xiàn)明顯的急性腎臟功能損傷，病理表現(xiàn)為腎臟水腫、腎小球皺縮明顯，腎組織彌漫嗜中性粒細胞浸潤，球囊擴張，腎小管上皮部分管型形成，細胞空泡變性、腫脹，腎小管腔閉塞，腎小管囊腔擴張，管型形成。同時伴隨肌酐、尿素氮升高。使用燈盞花素注射液可以顯著改善膿毒血癥大鼠腎臟病理改變，并且顯著降低血清肌酐、尿素氮水平，保護腎功能。

NGAL和KIM-1是近年發(fā)現(xiàn)的急性腎損傷的新的生物學標志物。NGAL是載脂蛋白家族成員，生理狀態(tài)下表達于中性粒細胞、腎小管上皮細胞等[11]，病理條件下由上皮細胞分泌。在尋找新型AKI標記物的研究中發(fā)現(xiàn)，從缺血和腎毒性小鼠模型中可以迅速檢測到NGAL濃度升高[12]。臨床研究證實，NGAL可以被視為評價幼兒患者行體外循環(huán)后發(fā)生AKI風險的指標[13]。目前NGAL被認為是一種早期的、靈敏的、非損傷性的反應AKI的標記物。KIM-1是腎臟近曲小管上皮細胞表達的一種跨膜蛋白，正常腎組織中表達水平極低，但在受損后再生的近曲小管上皮細胞中表達顯著增強并持續(xù)到細胞損傷完全修復[14]。其具有促進上皮細胞黏附的作用，與腎損傷的嚴重程度相關，尿中可檢測其可溶性片段[15]，并且在動物實驗中證實隨著腎損傷的加重，KIM-1的表達具有時間依賴性[16-17]。且具有較好的敏感性和特異性[18]，為一種檢測腎損傷的理想生物標志物。本研究發(fā)現(xiàn)，造模24h后膿毒血癥組大鼠血清NGAL和KIM-1水平及腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），燈盞花素注射液可明顯降低膿毒血癥大鼠血清NGAL和KIM-1水平及腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達水平。該結果進一步證實燈盞花素注射液對膿毒血癥小鼠急性腎損傷具有保護作用。

綜上所述，燈盞花素注射液對膿毒血癥大鼠急性腎損傷具有保護作用，從而為其應用于臨床膿毒血癥急性腎損傷患者的治療提供了實驗依據(jù)，其具體機制還需作進一步深入研究。

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Protective Effects of Breviscapus on Acute Kidney Injury in Rats with Sepsis

YANG Mei,ZHANG Yanjie,ZHU Haiping,WANG Dan,WANG Xiaorong,GAO Qiuqi,LI Zhuoying,PAN Jingye. Intensive Care Unit，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou(325000),China

Objective To investigate the effect of breviscapine on acute kidney injury in a rat model of sepsis. Methods Sixty male Wistar rats were randomly（random number）assigned to sham operation group（n=12）,sepsis group（n=12）,and sepsis treated with breviscapine groups（36 rats were divided into 3 groups according to the dose, n=12）.The rat model of sepsis was established by cecal ligation and puncture（CLP）.The rats were injected once a day with breviseapine i.v.（5mg/kg,10mg/kg,and 20mg/kg）after CLP were done;then the rats were killed after operations for 24 h to get blood and kidney.The levels of blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（Scr）were assayed by enzymatic assays,the serum level of neutrophil gelatinase associate lipoprotein(NGAL)and kidney injury molecule 1（KIM-1）was detected by ELISA,renal tissue injury was determined by HE,and the expression of NGAL and KIM-1 in kidney was detected by western blot.Results Compared with sepsis model,rats in breviscapine groups（10mg/kg and 20mg/kg)had the levels of BUN,Scr in plasma and NGAL and KIM-1 in both plasma and renal tissue decreased（all P＜0.05）,and improved renal pathology,but no significant improvement of renal pathology was observed in 5mg/kg breviscapine group（P＞0.05）.Conclusion Breviscapine can improve renal injury by reducing the level of NGAL and KIM-1 in plasma and renal tissue,thus it has protective effects on renal function in rats with sepsis.

rats；septic shock；sepsis；acute renal injury；breviscapine；NGAL；KIM-1

2014-03-28

修回日期：2014-07-15

浙江省溫州市科技計劃項目（No.Y20120207）

潘景業(yè)，Tel：15868724786；E-mail：biobabry@gmail.com