急性肺損傷大鼠各組織SP-A含量變化及相關(guān)性研究

李志軍鄭繼生李敏靜沈延飛蔡宛如

1浙江醫(yī)院呼吸科 杭州 310013 2浙江省立同德醫(yī)院呼吸內(nèi)科3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科 4浙江省東陽市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

急性肺損傷大鼠各組織SP-A含量變化及相關(guān)性研究

李志軍1鄭繼生2李敏靜3沈延飛4蔡宛如3

1浙江醫(yī)院呼吸科 杭州 310013 2浙江省立同德醫(yī)院呼吸內(nèi)科3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科 4浙江省東陽市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

目的 通過檢測(cè)急性肺損傷（ALI）模型大鼠肺、大腸等組織及肺泡灌洗液（BALF）、血清肺表面活化蛋白A（SP-A）含量變化并分析其相關(guān)性，為中醫(yī)“肺與大腸相表里”理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 采用脂多糖（LPS）氣道內(nèi)滴入制備急性肺損傷（ALI）大鼠模型，應(yīng)用ELISA方法分別檢測(cè)ALI及藥物干預(yù)后ALI大鼠肺、大腸等組織及肺泡灌洗液（BALF）、血清SP-A含量變化，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 隨著急性肺損傷加重，ALI模型大鼠肺、大腸、BALF及血清SP-A含量逐漸降低，藥物干預(yù)后能逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)，呈一致性變化。且干預(yù)前后肺與大腸SP-A表達(dá)具有相關(guān)性（r= 0.521，r=0.615，P＜0.01）。結(jié)論 SP-A在肺和大腸組織的含量變化相關(guān)性最密切。

大鼠；急性肺損傷；肺表面活化蛋白A；肺與大腸相表里

肺表面活化蛋白A（surfactant protein A，SP-A）為肺表面活化蛋白中最早發(fā)現(xiàn)及含量最豐富者，是肺表面活性物質(zhì)（pulmonary surfactant，PS）中最重要的蛋白成分，在維持PS結(jié)構(gòu)和功能、降低肺表面張力、調(diào)節(jié)肺的免疫防御及炎癥反應(yīng)等方面有重要作用。羅俊銘等[1]研究表明，SP-A相似分子在腸道上皮、腸道絨毛表面，連接組織血管和某些炎癥細(xì)胞中分布。Rubio等[2]也發(fā)現(xiàn)在大鼠腸道上皮細(xì)胞中能表達(dá)SP-A相似分子，并且其編碼序列與肺組織中的SP-A完全一致。結(jié)合“肺與大腸表里相合”的中醫(yī)理論，我們推測(cè)SP-A在肺與大腸組織中的表達(dá)可能存在著某種相關(guān)性，為此進(jìn)行了相關(guān)研究，旨在為中醫(yī)“肺與大腸相表里”的理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 健康雄性SD大鼠120只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016）。

1.2 試劑及材料 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（批號(hào)E.coli內(nèi)毒素055：B5，美國(guó)Sigma公司）；SP-A ELISA試劑盒（美國(guó)RND公司進(jìn)口分裝）；RIPA裂解緩沖液（普利萊基因技術(shù)有限公司）；蛋白酶抑制劑混合物（達(dá)文生物有限公司）。

1.3 藥 物 芪冬活血飲由黃芪、麥冬、虎杖、當(dāng)歸按5：3：5：3比例組成，大黃湯由一味大黃組成。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制成，含生藥1g/mL，存放4℃冰箱保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 急性肺損傷（acute lung injury，ALI）實(shí)驗(yàn) 60只大鼠分為空白對(duì)照組、生理鹽水組、ALI 12h組、ALI 24h組、ALI 36h組和ALI 48h組，每組10只；ALI造模采用氣管內(nèi)注入 LPS法制備 ALI大鼠模型（0.3mg/kg）[3]，生理鹽水（normal saline，NS）組及陰性對(duì)照組氣管內(nèi)注入等量NS；空白對(duì)照組不作處理。

2.2 急性肺損傷藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn) 60只大鼠分為陰性對(duì)照組、模型組、芪冬活血飲組、芪冬大黃組、大黃組及地塞米松組，每組10只。ALI造模同上，藥物干預(yù)方法：①芪冬組在造模前24h、12h及造模后12h分別予芪冬活血飲8g/kg灌胃；②芪冬大黃組在造模前24h、12h及造模后12h分別予8g/kg芪冬活血飲和10g/kg大黃湯灌胃；③地塞米松組在造模前24h、12h及造模后12h分別予地塞米松5mg/kg灌胃；④大黃組在造模前24h、12h及造模后12h分別予大黃湯灌胃10g/kg；⑤陰性對(duì)照組及模型組在造模前24h、12h及造模后12h分別予等量生理鹽水灌胃。

2.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) ALI 12h組、ALI 24h組、ALI 36h組、ALI 48h組分別于注入LPS后12、24、36、48h，NS組與空白對(duì)照組均于48h后；急性肺損傷干預(yù)后各組均在造模后24h，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，采集血清、肺泡灌洗液（BALF）及肺組織標(biāo)本，組織勻漿獲取方法采取既往實(shí)驗(yàn)所述[4]。采用ELISA檢測(cè)各組織SP-A含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用One-way ANOVA檢驗(yàn)，予以方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)組間比較用LSD法，方差不齊時(shí)組間比較用Tamhane's T2法。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠組織SP-A含量比較 隨著LPS作用時(shí)間延長(zhǎng)，肺、大腸組織、BALF及血清SP-A含量呈逐步下降趨勢(shì)，ALI 12h組、ALI 24h組、ALI 36h組及ALI 48h組均明顯低于NS組和空白對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。ALI 24h組、ALI 36h組及ALI 48h組肺、血清SP-A含量顯著低于ALI 12h組（P＜0.05或P＜0.01）；ALI 48h組大腸、BALF的SP-A含量顯著低于ALI 24h組（P＜0.01）；皮膚組織SP-A含量隨著LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng)變化不明顯（P＞0.05）；空白對(duì)照組肝組織SP-A含量顯著高于其它各組（P＜0.05）；ALI 48h組皮膚組織中SP-A含量最低，與空白對(duì)照組、NS組、ALI 12h組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺、大腸、BALF、血清、皮膚及肝組織SP-A含量比較（±s） ng/L

表1 各組大鼠肺、大腸、BALF、血清、皮膚及肝組織SP-A含量比較（±s） ng/L

注：與NS組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與ALI 12h組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與ALI 24h組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

組別空白對(duì)照組NS組ALI12h組ALI24h組ALI36h組ALI48h組n/只10 10 10 10 10 10肺肝176.36±27.81* 236.72±44.86 151.87±24.90* 119.63±11.93*△△▲110.00±12.88*△△▲112.51±10.88**△△▲大腸85.20±8.11 89.03±10.21 74.52±11.01* 72.54±18.48*△△59.76±14.15*△△◇53.29±12.76**△△◇◇BALF 439.17±26.09** 528.04±34.81 456.84±65.78** 404.49±30.48**▲372.79±37.31**△△▲▲348.12±59.44**△△◇◇血清439.00±12.98 473.68±35.21△▲430.67±30.28 394.68±53.36**△△▲389.65±45.53**△△▲388.27±42.21**△△▲皮膚80.41±16.45 88.47±8.31 87.16±9.26 68.93±22.11 74.74±15.28 4.91±14.55*△▲126.77±30.10 82.33±11.53△86.68±8.66△87.58±13.76△80.24±4.97△86.22±6.87△

表2 干預(yù)后各組大鼠肺、大腸、血清及BALF SP-A含量比較（±s） ng/L

表2 干預(yù)后各組大鼠肺、大腸、血清及BALF SP-A含量比較（±s） ng/L

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與地塞米松組比較，▲P＜0.05；與芪冬大黃組比較，◇P＜0.05

組別陰性對(duì)照組模型組DXM組芪冬大黃組芪冬組大黃組n/只10 10 10 10 10 10血清431.09±27.82 332.28±11.18** 400.55±44.73△△380.56±43.78**△△379.87±17.68**△△371.16±45.91**△△BALF 485.29±19.65 375.68±20.41* 433.23±34.50*△443.75±65.42*△411.64±61.00* 404.36±37.11*肺190.75±15.17 120.85±9.33** 179.43±24.02△△178.40±19.39△△158.39±18.96**△△▲◇160.89±8.46**△△▲◇大腸82.36±6.18 64.47±5.67** 78.04±5.39△△75.88±4.68△△71.13±4.57** 69.20±6.58**

3.2 干預(yù)后大鼠各組織SP-A含量比較 模型組肺、大腸、BALF及血清SP-A含量較對(duì)照組均有不同程度降低（P＜0.05或P＜0.01），經(jīng)地塞米松、芪冬活血飲、大黃和芪冬活血飲聯(lián)合大黃藥物干預(yù)后均有恢復(fù)，干預(yù)后肺、大腸、BALF及血清中SP-A變化規(guī)律具有一致性。見表2。

3.3 ALI大鼠肺組織與其它組織SP-A含量相關(guān)性分析 對(duì)ALI大鼠肺組織SP-A與BALF、大腸、皮膚、肝組織及血清SP-A表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù) r分別為 0.658、0.521、0.445、0.106、0.626，ALI大鼠肺組織SP-A表達(dá)與BALF、大腸、皮膚、血清SP-A表達(dá)具有相關(guān)性（P＜0.01）。ALI大鼠干預(yù)后肺組織SP-A與BALF、大腸及血清SP-A含量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r分別為0.418、0.615、0.558，均具有相關(guān)性（P＜0.01）。

4 討論

“肺與大腸相表里”理論源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，它是中醫(yī)學(xué)論述臟腑表里關(guān)系的重要內(nèi)容之一，《靈樞·本輸》篇稱這種關(guān)系為“肺合大腸，大腸者，傳導(dǎo)之府也”，《素問·血?dú)庑沃尽菲Q之為“陽明與太陰為表里”。在生理上體現(xiàn)了肺主氣和大腸主傳導(dǎo)之間的相互作用；病理上體現(xiàn)肺和大腸在病變時(shí)相互影響；治療上體現(xiàn)臟病腑治、腑病臟治、臟腑同治提高臨床療效。盡管該理論在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中行之有效，但仍有必要借助分子生物學(xué)手段來深入闡釋其內(nèi)在的本質(zhì)聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ALI大鼠肺及大腸組織、BALF及血清SP-A含量呈逐步下降趨勢(shì)（P＜0.05或P＜0.01），而皮膚及肝組織不存在上述變化，表明SP-A含量在肺與大腸、血清和BALF中具有一致性變化。進(jìn)一步對(duì)肺組織與BALF、大腸、皮膚、肝組織及血清SP-A含量變化進(jìn)行相關(guān)性分析，提示肺組織SP-A表達(dá)與BALF、大腸、皮膚及血清SP-A表達(dá)均呈正相關(guān)，同肝組織無明顯相關(guān)（r=0.106，P＞0.05），但在肺外臟器中，同大腸的相關(guān)性最密切（r=0.521，P＜0.01）。

筆者發(fā)現(xiàn)，LPS氣管內(nèi)局部滴注誘導(dǎo)ALI后24h，肺組織和大腸組織SP-A含量均呈現(xiàn)下降，而這種下降經(jīng)藥物干預(yù)后均有不同程度的恢復(fù)，提示SP-A在肺組織和大腸組織的表達(dá)呈一致性。進(jìn)一步通過對(duì)肺與大腸、血清及BALF SP-A的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)后肺組織SP-A濃度同BALF、大腸及血清的SP-A濃度均呈正相關(guān)，但與大腸相關(guān)最密切。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SP-A在肺與大腸含量變化的相關(guān)性最密切，提示SP-A可能是中醫(yī)“肺與大腸相表里”的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

［1］羅俊銘，劉昭前，Chin Y.Eugene.肺表面活化蛋白A相似分子在炎癥腸道疾病組織中的過量表達(dá)［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，33（11）：979-986.

［2］Rubio S，Lacaze-Masmonteil T，Chailley-Heu B，et al.Pulmonary surfactant protein A（SP-A）is expressed by epithelial cells of small and large intestine［J］.Biol Chem，1995，270：12062-12063

［3］朱耀斌，李曉鋒，張燕博，等.急性肺損傷動(dòng)物模型［J］.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2011，25（7）：625-628.

［4］李志軍，丁志山，董雷，等.芪冬活血飲對(duì)急性肺損傷大鼠肺表面活性蛋白A在肺與大腸表達(dá)的影響及相關(guān)性研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（3）：698-702.

［5］ Liu J，Hu F，Wang G，et al.Lipopolysaccharide-induced expression of surfactant proteins A1 and A2 in human renal tubular epithelial cells［J］.J Inflamm（Lond），2013，10（1）：2.

Change of SP-A in Several Tissues of Acute Pulmonary Injury Rats

LI Zhijun1，ZHENG Jisheng2，LI Min-jing3，SHEN Yanfei4，CAI Wanru3. 1.Department of Respiratory Diseases，Zhejiang Hospital，Hangzhou（310013），China;2.Department of Respiratory Diseases，Zhejiang Provincial Tongde Hospital;3.Department of Respiratory Diseases，the Second Hospital affiliated to Zhejiang Chinese Medical University;4.Department of Severe Diseases，Dongyang People's Hospital.

Objective To detect the change of SP-A in several tissues of rats with acute lung injury（ALI）and further discuss the SP-A correlation in different tissues,so as to provide experimental basis for the Traditional Chinese Medical theory"The lung and large intestine have an exterior-interior relationship". Methods ALI model was made by instilling lipopolysaccharide into in trachea of rats.The level of SP-A was detected by ELISA in lung and large intestine tissues and serum samples and BALF of ALI rats before and after interfering.A correlation analysis was carried out.Results With the aggravation of ALI,the level of SP-A in lung and large intestine tissue,BALF and serum samples were gradually declining,but the deceased was reversed by drug treatment,showing a consistency change.The level of SP-A in lung tissue was correlated with that in large intestine tissue（r=0.521 in ALI and r=0.615 after intervening,P＜0.01）.Conclusion The SP-A in lung tissue is closely related with that in large intestine.

rats；acute lung injury；SP-A；Lung and large intestine have exterior-interior relationship

2014-04-24

修改日期：2014-06-25

浙江省自然科學(xué)基金（No.Y2091208）

蔡宛如，Tel：0571-85267000；E-mail：caiwanru@yahoo.com.cn