何首烏提取物對正常與荷肝癌小鼠的急性肝毒性研究Δ

葛珍珍，張超，馮光遠，楊紅莉，石璐緣，孫震曉（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，味苦、甘、澀，氣微溫，歸肝、心、腎經(jīng)，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便之功效[1]。藥物性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）是指由藥物本身或其代謝產(chǎn)物引起的肝損傷。目前已知，數(shù)以千計的藥物可引起肝損傷或有潛在肝毒性；很多藥物的賦形劑、中草藥以及保健藥亦有導(dǎo)致肝損傷的可能[2]。臨床報道何首烏有一定肝毒性，癥狀類似急性肝炎[3-5]，會加重肝功能異常病情；服用何首烏可對乙肝患者造成較嚴重的肝損傷[6]。筆者在體外篩選何首烏肝毒性成分時發(fā)現(xiàn)，何首烏乙醇提取物大孔樹脂吸附后95%乙醇洗脫部位（簡稱R95部位）及其主要成分大黃素能明顯誘導(dǎo)人肝實質(zhì)細胞凋亡[7]，但進一步動物實驗研究發(fā)現(xiàn)R95部位及大黃素的肝毒性不明顯（尚未發(fā)表）。另外，何首烏乙醇提取物大孔樹脂吸附后50%乙醇洗脫部位（簡稱R50部位）對人肝細胞也有一定毒性作用，并在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對人肝癌細胞具較強的殺傷作用而對人肝實質(zhì)細胞的影響較小，R50部位及其主要成分在動物實驗中的表現(xiàn)值得進一步研究[8]。

本研究主要報道何首烏總提物及其R50部位、R50部位主要成分 2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-d-葡糖苷（2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside，TSG）和 大 黃素-8-O-β-d-葡糖苷（Emodin-8-O-β-d-Glucoside，EG）對 ICR正常小鼠的肝毒性，以及R50部位對荷肝癌小鼠肝毒性的實驗研究結(jié)果，以為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TGL-20M臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；AU-400全自動生化分析儀（日本Olympus公司））。

1.2 藥材

何首烏藥材購自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司（批號:701001037），經(jīng)筆者鑒定為真品。

1.3 藥品與試劑

TSG（中國食品藥品檢定研究院，批號:110844-200908）；EG（四川維克奇生物科技有限公司，批號:20714，純度:≥98%）；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 動物

ICR小鼠60只與荷肝癌H22小鼠40只，♂，體質(zhì)量（20±2）g，均購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心[實驗動物使用許可證號:SCXK（京）2011-0012]。

2 方法

2.1 何首烏總提物與R50部位的提取

常規(guī)煎煮獲取何首烏總提物，將何首烏總提物用AB-8大孔樹脂吸附，先用水洗脫至洗脫液無色，再用50%乙醇洗脫至洗脫液無色，收集R50部位，貯藏，備用。

2.2 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠的影響

2.2.1 分組與給藥 50只ICR小鼠隨機均分為5組，即正常對照（等容0.5%CMC-Na溶液）組、何首烏總提物（1500mg/kg）組、R50部位（500mg/kg）組、TSG（185mg/kg）組、EG（2mg/kg）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)10d。

2.2.2 一般情況觀察 每天觀察小鼠被毛、攝食、活動、排便等情況，定期稱量小鼠體質(zhì)量。

2.2.3 指標的測定 （1）AST、ALT活性的測定:按AST、ALT測試盒說明書測定AST、ALT活性。（2）肝臟系數(shù)的計算:末次給藥1 h后處死小鼠，解剖觀察各組小鼠肝臟大體情況，取小鼠肝臟稱質(zhì)量，按臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，計算肝臟系數(shù)。

2.3 R50部位對荷肝癌小鼠的影響

2.3.1 分組與給藥 40只荷肝癌H22小鼠隨機均分為4組，即模型（等容0.5%CMC-Na溶液）組與R50部位高、中、低劑量（1000、500、250mg/kg）組，另取10只正常小鼠作正常對照（等容0.5%CMC-Na溶液）組。ig給藥，每天1次，共10d。

2.3.2 指標的測定 按“2.2.2”與“2.2.3”項下方法測定指標。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠的影響

3.1.1 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠一般情況的影響 給藥期間各組小鼠一般情況均無異常，體質(zhì)量增加趨勢相同（P＞0.05）。何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠體質(zhì)量的影響見圖1。

圖1 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠體質(zhì)量的影響Fig 1 Effects of F.multiflorum total extract，R50 part，TSG and EG on body weight of normal mice

3.1.2 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠血清AST、ALT活性的影響 各組小鼠血清AST、ALT活性無明顯差異（P＞0.05）。何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠血清AST、ALT活性的影響見表1。

表1 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠血清AST、ALT活性的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of P.multiflorum total extract，R50 part，TSG and EG on the activities of AST and ALT in normal mice（，n＝10）

表1 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠血清AST、ALT活性的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of P.multiflorum total extract，R50 part，TSG and EG on the activities of AST and ALT in normal mice（，n＝10）

組別正常對照組R50部位組TSG組EG組何首烏總提物組AST，U/L 33.70±5.2737.67±19.9837.58±17.4031.37±2.6235.97±4.07 ALT，U/L 28.68±10.5727.08±17.6327.13±10.7022.98±12.2627.47±12.63

3.1.3 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠肝臟系數(shù)的影響 各組小鼠肝質(zhì)量與肝臟系數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠肝臟系數(shù)的影響見表2。

表2 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠肝臟系數(shù)的影響（，n＝10）Tab 2 Effects of P.multiflorum total extract，R50 part，TSG and EG on liver coefficient in normal mice（，n＝10）

表2 何首烏總提物、R50部位及TSG、EG對正常小鼠肝臟系數(shù)的影響（，n＝10）Tab 2 Effects of P.multiflorum total extract，R50 part，TSG and EG on liver coefficient in normal mice（，n＝10）

組別正常對照組R50部位組TSG組EG組何首烏總提物組體質(zhì)量，g 27.87±1.1725.78±1.6926.83±1.9327.69±1.8625.74±1.81肝質(zhì)量，g 1.35±0.181.24±0.101.25±0.091.30±0.161.27±0.17肝臟系數(shù)，%4.81±0.414.57±0.204.65±0.194.70±0.534.91±0.42

3.2 R50部位對荷肝癌小鼠的影響

3.2.1 R50部位對荷肝癌小鼠體質(zhì)量的影響 給藥期間，各給藥組小鼠均有腹瀉現(xiàn)象，隨藥物質(zhì)量濃度的增加癥狀明顯加強。實驗結(jié)束時與正常對照組比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量減輕，其中R50部位中劑量組小鼠體質(zhì)量明顯減少。R50部位對荷肝癌小鼠體質(zhì)量的影響見圖2。

圖2 R50部位對荷肝癌小鼠體質(zhì)量的影響Fig 2 Effects of R50 part on body weight of model mice

3.2.2 R50部位對荷肝癌小鼠血清AST、ALT活性的影響 與正常對照組比較，模型組與R50部位高、中、低劑量組小鼠血清AST、ALT活性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，R50部位高、中劑量組小鼠血清ALT活性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。R50部位對荷肝癌小鼠血清AST、ALT活性的影響見表3。

表3 R50部位對荷肝癌小鼠血清AST、ALT活性的影響（，n＝10）Tab 3 Effects of R50 part on AST and ALT of model mice（，n＝10）

表3 R50部位對荷肝癌小鼠血清AST、ALT活性的影響（，n＝10）Tab 3 Effects of R50 part on AST and ALT of model mice（，n＝10）

與正常對照組比較:＊P＜0.05；與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.05；vs.model group:#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組R50部位低劑量組R50部位中劑量組R50部位高劑量組ALT，U/L 35.35±3.3664.23±18.83＊54.20±17.07＊104.72±13.54＊##86.65±19.92＊#AST，U/L 35.81±10.32106.16±17.13＊92.12±30.08＊90.43±20.69＊174.60±37.47＊

3.2.3 連續(xù)給藥對荷肝癌小鼠肝臟系數(shù)的影響 與正常對照組比較，模型組與R50部位高、中、低劑量組小鼠肝臟系數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，R50部位中劑量組小鼠肝臟系數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組小鼠肝質(zhì)量變化不大，說明肝臟系數(shù)的增加主要為小鼠體質(zhì)量下降引起。連續(xù)給藥對荷肝癌小鼠肝臟系數(shù)的影響見表4。

表4 連續(xù)給藥對荷肝癌小鼠肝臟系數(shù)的影響（，n＝10）Tab 4 Effects of successive administration on liver coefficient of model mice（，n＝10）

表4 連續(xù)給藥對荷肝癌小鼠肝臟系數(shù)的影響（，n＝10）Tab 4 Effects of successive administration on liver coefficient of model mice（，n＝10）

與正常對照組比較:＊P＜0.05；與模型組比較:#P＜0.05vs.normal control group:＊P＜0.05；vs.model group:#P＜0.05

組別正常對照組模型組R50部位低劑量組R50部位中劑量組R50部位高劑量組肝臟系數(shù)，%3.82±0.404.95±0.67＊4.97±0.71＊5.91±0.46＊#4.95±0.50＊體質(zhì)量，g 28.84±1.8330.01±1.9928.10±2.0824.60±3.8926.85±2.31肝質(zhì)量，g 1.11±0.161.48±0.211.40±0.271.45±0.271.33±0.20

4 討論

本研究通過對正常及荷肝癌小鼠ig何首烏提取物、R50部位及TSG、EG，觀察各組小鼠被毛、攝食、排泄、體質(zhì)量等一般情況及肝功能血清酶學(xué)、臟臟系數(shù)等指標，初步考察并比較何首烏及其所含成分對正常及荷肝癌小鼠肝臟損傷的情況。結(jié)果表明，何首烏及其R50部位、TSG、EG對正常小鼠一般情況均沒有明顯影響，各成分均沒有表現(xiàn)明顯的肝毒性，但對荷肝癌小鼠，同樣劑量的R50部位可引起荷肝癌小鼠腹瀉、體質(zhì)量減輕，并加劇荷肝癌小鼠的肝損傷。

近年來，隨著臨床上何首烏肝毒性的病例報告增多，其肝毒性研究逐漸受到關(guān)注。有報道小鼠單次ig一定劑量的何首烏水提組分或醇提組分可造成急性肝損傷，并呈現(xiàn)一定的“量-時-毒”關(guān)系[9]。考慮到臨床上何首烏發(fā)生急性肝毒性的時間一般在連續(xù)用藥1～4周，最短1～6 d[3-4]，本研究選用何首烏臨床用藥100倍的劑量作用小鼠10d，考察其肝毒性作用，結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的肝毒性。雖然選取考察的與肝損傷相關(guān)的指標與前者基本相同，如血液生化指標及肝臟系數(shù)等，但所用何首烏來源、提取方法、給藥時間和劑量、小鼠品種等均不相同，結(jié)果尚不好比較。但是，筆者前期用SD大鼠所做的何首烏提取物的30d及60 d的實驗與本實驗結(jié)果基本吻合:大鼠30d及60 d實驗中，各給藥組大鼠肝臟系數(shù)及氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT、AST）沒有明顯變化。雖然大鼠肝臟病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，60 d給藥組大鼠脂肪變性、炎細胞浸潤較明顯，并隨藥物劑量加大而加重，但各給藥組均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的肝細胞壞死、膽汁淤積等病變[10]，這與臨床上何首烏引起的急性肝毒性如ALT急劇升高、肝細胞凋亡或壞死等明顯不同[3-4]。結(jié)合目前血清藥理學(xué)研究結(jié)果[11]，考慮何首烏肝毒性的發(fā)生可能與患者藥物代謝酶異常有關(guān)，相關(guān)實驗研究正在進行中。

近來研究發(fā)現(xiàn)，何首烏有一定抗腫瘤作用[12]，利用體外細胞系筆者發(fā)現(xiàn)R50部位在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對人肝癌細胞有明顯的抑制作用而對人肝實質(zhì)細胞的影響較小[8]。本研究考察了其對荷肝癌小鼠肝臟的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R50部位加劇了荷肝癌小鼠的肝功能異常。何首烏為補益藥類，臨床上常用于滋補肝腎的復(fù)方，提示臨床上對已有肝功能異常的患者如肝炎或肝癌患者使用何首烏或含何首烏制劑時要慎重，注意監(jiān)測肝功，以免造成二次傷害。

以往有關(guān)蒽醌類的實驗研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合蒽醌致泄作用比游離蒽醌強[13]。本研究中R50部位ig荷肝癌小鼠，各給藥組小鼠均有腹瀉現(xiàn)象，隨藥物質(zhì)量濃度的增加癥狀明顯加強，實驗結(jié)束時各給藥組與正常對照組比較體質(zhì)量減輕，分析原因可能與其含有較多結(jié)合蒽醌有關(guān)，動物荷肝癌后胃腸功能下降，故R50部位組荷肝癌小鼠腹瀉及體質(zhì)量減輕較明顯。

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