POR基因多態(tài)性與華法林維持劑量關(guān)系的研究

胡 蓉，許 哲，趙立子，李嘉麗，王雪丁，鄭綺姍，3，張 希，黃 民

（1.中山大學(xué)臨床藥理研究所，廣東廣州 510080；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心外科，廣東 廣州 510080；3.中山市人民醫(yī)院，廣東中山 528400）

華法林是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的口服抗凝藥之一，尤其是接受人工心臟機械瓣膜置換術(shù)（artificial mechanical heart valve replacement，AMHVR）的患者，需要在術(shù)后終生服用華法林進行抗凝治療。但是，華法林的治療窗狹窄，個體差異大，過高或過低的給藥劑量均可導(dǎo)致包括大出血及各種血栓栓塞在內(nèi)的嚴重不良反應(yīng)。目前，臨床上主要通過檢測國際化標(biāo)準比值 （international normalized ratio，INR）指導(dǎo)臨床給藥。雖然通過檢測INR值可以一定程度上減少不良反應(yīng)的發(fā)生，但是這種方法存在一定滯后性。近20年來，國內(nèi)外相關(guān)研究一直致力于尋找影響華法林個體差異的因素，并嘗試建立給藥劑量預(yù)測模型以指導(dǎo)華法林的個體化臨床用藥。

藥物基因組學(xué)研究迄今已發(fā)現(xiàn)一些影響華法林代謝及藥效作用的重要受體及酶，其中影響最大的兩個因素是維生素K氧化還原酶復(fù)合體系1（vitamin K epoxide reductase complex 1，VKORC1）及細胞色素 P450氧化酶 2C9（cytochrome P450 2C9，CYP2C9）［1－2］，本實驗室的前期研究也證實了這些發(fā)現(xiàn)［3－4］。在此基礎(chǔ)上，我們還發(fā)現(xiàn)細胞色素P450氧化 酶 4F2（cytochrome P450 4F2，CYP4F2）rs2108622［3］以及孕烷 X受體（pregnane X receptor，PXR）編碼基因 NR1I2（nuclear receptor subfamily 1，group I，member 2）7635G＞A［4］與華法林維持劑量存在一定的相關(guān)性。綜合上述基因及臨床因素可解釋50%［1－4］左右的華法林劑量個體差異，尚有將近一半的個體差異無法得到解釋，這也提示是否還有其他遺傳因素被忽略了。

近年來，細胞色素P450氧化還原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，POR）引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。POR是人肝微粒體細胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP）的唯一電子供體，由于POR是 CYP酶發(fā)揮活性的限速步驟，其遺傳多態(tài)性可能對藥物的體內(nèi)代謝產(chǎn)生重要影響［5］。因此，本研究旨從POR基因位點多態(tài)性著手，探究其基因多態(tài)性對華法林維持劑量的影響。

1 材料與方法

1.1 受試對象 本研究納入2012年12月至2013年5月期間，于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心外科門診進行復(fù)查的中國漢族人工心臟機械瓣膜置換術(shù)患者，共185例。入選患者均經(jīng)半年以上華法林抗凝治療，各項基礎(chǔ)生化指標(biāo)和肝腎功能指標(biāo)正常，INR值穩(wěn)定在1.8－2.5的目標(biāo)范圍內(nèi)，且華法林劑量至少維持3個月無變動。病人未合用已有文獻報道的可能影響華法林穩(wěn)定劑量的藥物，如胺碘酮、他汀類藥物、氯吡格雷等。本研究獲得中山大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，入選患者均已閱讀并簽訂知情同意書。

1.2 試劑與儀器 引物（中國Sangon公司），Complete iPLEX?Gold Genotyping Reagent Set96試劑盒（美國 SEQUENOM公司）；CoaguCheck?康固全凝血監(jiān)測儀 （瑞典Roche公司），ABIGeneAmp?PCR儀（美國 Applied Biosystems公司），MassARRAY?Genetic Analysis System（美國SEQUENOM公司），臺式高速低溫冷凍離心機（日本HITACHI公司）。

1．3 患者INR值及華法林維持劑量的獲得 患者定期來門診復(fù)診時，將抽取患者100μl外周靜脈血，滴在嵌入凝血監(jiān)測儀中的一次性專用試紙上，利用凝血檢測儀快速準確測定患者的INR值。記錄該患者相應(yīng)的檢測日期及INR值，并通過查閱患者的醫(yī)院電子病歷、當(dāng)面詢問及電話回訪等方式確定患者的合并用藥情況及華法林用藥劑量。對于INR值連續(xù)3個月穩(wěn)定在1.8～2.5，且無劑量調(diào)整變化的患者，可認為其華法林劑量達穩(wěn)。

1．4 基因組DNA提取 參照并優(yōu)化Loparev等［6］的碘化鈉法。①取EDTA抗凝全血100μl，加無菌雙蒸水 200μl，6 mol·L－1碘化鈉 200μl，混勻；②加入氯仿：異戊醇（24∶1）400μl，渦旋混勻后再離心10 min，取上清；③ 向上清液加入異丙醇300μl，混勻后再離心10 min，棄上清；④ 加70%乙醇500 μl，離心3 min，棄液體；⑤ 重復(fù)步驟④1次后，晾干離心管，加入TE緩沖液40μl，所得DNA于－20℃保存。

1．5 Sequenom M assARRAY?SNP基因型分析檢測 VKORC1 rs9934438和 POR各位點：POR rs2868177、POR rs17685、POR rs17148944、POR rs56256515及POR rs72553971的引物序列由Sequenom網(wǎng)站（https：／／www.mysequenom.com／Tools）在線設(shè)計得到，引物見Tab 1；以上基因型檢測均經(jīng)過 Sequenom MassARRAY?SNP分析。Sequenom MassARRAY?SNP分析過程主要包括：PCR反應(yīng)擴增，SAP反應(yīng)純化及延伸反應(yīng)。在加樣器中自動點樣完成后，即可將芯片放入真空儀中進行質(zhì)譜檢測，出具基因型分析報告。CYP2C9*3檢測則使用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP），所用引物及方法參照 Cen J等［3］。

Tab 1 Forward，reverse and extension prem iers for target POR and VKORC1 SNPs

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。由于華法林劑量呈偏態(tài)分布，需先將其進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，使用ANOVA或t檢驗比較各基因型組下的log劑量。

2 結(jié)果

2.1 受試對象臨床資料 本研究共納入185例中國漢族人工心臟機械瓣膜置換術(shù)患者，其中男性85例（45.9%），女性100例（54.1%）；年齡跨度為18歲～77歲，平均（46.3±12.5）歲，身高（161.8±7.6）cm，體重（60.3±10.6）kg；INR值范圍為1.8～2.5；華法林達穩(wěn)劑量為（3.21±1.03）mg·d－1，其中最低劑量為1.25 mg·d－1，最高劑量為7.50 mg·d－1。

2.2 基因型分布頻率 在納入研究的185例中國漢族人工心臟機械瓣膜置換術(shù)患者中，未發(fā)現(xiàn)POR rs17148944、POR rs56256515及 POR rs72553971位點的突變。其他位點的具體頻率分布見Tab 2。

Tab 2 Genotype and allele frequency data for4 SNPs studied in 185 Han Chinese patients w ith AMHVR

2．3 VKORC1 rs9934438與CYP2C9*3對華法林維持劑量的影響 將VKORC1 rs9934438 GG型與GA型合并，各基因型組患者的劑量分別為：AA型為（2.92±0.75）mg·d－1，GA＋GG型為（4.31±1.14）mg·d－1，P＜0.01。將 CYP2C9*1*3與CYP2C9*3*3合并，各基因型組患者的劑量分別為：CYP2C9*1*1為 （3.32±1.02）mg·d－1，CYP2C9*3為（2.06±0.81）mg·d－1，P＜0.01。

2．4 POR各SNP對華法林維持劑量的影響 POR rs17685各基因型組患者的華法林維持劑量分別為CC型（3.09±0.97）mg·d－1，CT型（3.33±1.06）mg·d－1，TT型（3.47±1.26）mg·d－1，P＝0.10。POR rs2868177各基因型組患者的華法林維持劑量分別為 GG型（3.18±1.10）mg·d－1，GA型（3.31±1.00）mg·d－1，AA型（3.34±1.10）mg·d－1，P＝0.50。

2．5 POR各SNP對攜帶CYP2C9*1*1患者華法林維持劑量的影響 CYP2C9*3突變會導(dǎo)致華法林的主要代謝酶CYP2C9酶活性降低為野生型活性的5%［7］，使華法林在患者體內(nèi)的清除率降低，血藥濃度升高；但此突變在亞洲人的發(fā)生頻率低，僅為3%～5%左右［8］。鑒于 CYP2C9*3突變的樣本量較小，且可能作為混雜因素干擾POR基因多態(tài)性對華法林劑量的影響，因而為了排除其潛在的影響，剔除CYP2C9*3攜帶者后，將POR rs17685各基因型分為CC型組和攜帶T突變的CT＋TT組，CC型患者的華法林維持劑量明顯高于CT和TT型患者（3.50±1.07）mg·d－1vs（3.14±0.94）mg·d－1，P＝0.03，見Fig 1。POR rs2868177各基因型組患者的華法林維持劑量分別為GG型組（3.20±0.97）mg·d－1，GA型組（3.37±1.03）mg·d－1，AA型組（3.56±1.14）mg·d－1，P＝0.35。

Fig 1 Effects of POR rs17685 on log＿warfarin maintenance dose in Han Chinese AMHVR patients carrying CYP2C9*1*1*P＜0.05 compared between the two groups.

2．6 POR各 SNP對同時攜帶CYP2C9*1*1和VKORC1 rs9934438 AA型患者或同時攜帶CYP2C9*1*1和 VKORC1 rs9934438 GA／GG型患者華法林維持劑量的影響 本課題前期研究結(jié)果［3－4］及 本 次 研 究 初 步 分 析 均 顯 示 VKORC1 rs9934438對華法林維持劑量個體差異影響明顯，因而其可能干擾POR各SNPs對華法林維持劑量的影響。故進一步固定VKORC1 rs9934438 AA型和VKORC1 rs9934438 GA／GG型，分別考察在同時攜帶CYP2C9*1*1和VKORC1 rs9934438 AA型以及同時攜帶CYP2C9*1*1和VKORC1 rs9934438 GA／GG型下，POR各SNPs對患者華法林維持劑量的影響。

對于同時攜帶CYP2C9*1*1和 VKORC1 rs9934438 AA型的患者，POR rs17685各基因型組患者的華法林維持劑量分別為CC型組（2.91±0.77）mg·d－1，CT型組（2.94±0.59）mg·d－1，TT型組（3.11±0.89）mg·d－1，P＝0.56。POR rs2868177各基因型組患者的華法林維持劑量分別為 GG型組（2.94±0.85）mg·d－1，GA型組（3.00±0.71）mg·d－1，AA型組（3.04±0.62）mg·d－1，P＝0.55。

對于同時攜帶CYP2C9*1*1和 VKORC1 rs9934438 GA／GG型的患者，將 POR rs17685各基因型分為CC型組和攜帶T突變的CT＋TT組，各基因型組患者的華法林維持劑量分別為CC型組（4.08±1.03）mg·d－1，CT＋TT型組（4.76±0.90）mg·d－1，P＝0.04，見 Fig 2。POR rs2868177各基因型組患者的華法林維持劑量分別為GG型組（4.16±1.24）mg·d－1，GA型組（4.62±0.60）mg·d－1，GG型組（4.69±1.23）mg·d－1，P＝0.53。

Fig 2 Effects of POR rs17685 on log＿warfarin maintenance dose in Han Chinese AMHVR patients carrying CYP2C9*1*1＆VKORC1 rs9934438 GA／GG*P＜0.05 compared between the two groups.

3 討論

細胞色素P450氧化還原酶POR位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，由人類第7號染色體的POR基因編碼。POR是所有肝微粒體CYPs催化體系中的唯一電子供體，通過黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）和黃素單核苷酸（flavinmononucleotide，F(xiàn)MN）這兩個黃素結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)－復(fù)構(gòu)，將電子從NADPH傳遞給CYP酶，使其在獲得電子后催化底物的氧化還原反應(yīng)［9］。

華法林在體內(nèi)主要經(jīng)過CYP2C9代謝，此外CYP3A4、CYP1A2等也參與其代謝過程。作為CYP的重要組成部分，POR的遺傳多態(tài)性可通過改變電子傳遞活性或影響其自身表達和功能，從而影響相關(guān)CYP酶的催化活性，進而對藥物在體內(nèi)代謝產(chǎn)生重要影響。

本次研究主要選取了5個POR位點，其中POR rs56256515及POR rs17148944已有體外功能研究報道。POR rs56256515［10］的突變型比野生型的活性低80%，可明顯降低CYP2C9及CYP3A4等酶的活性。POR rs17148944［11］位于POR內(nèi)含子2區(qū)，可影響CYP3A4對藥物的氧化作用。但本次研究中未在目標(biāo)人群中發(fā)現(xiàn)這兩個位點的突變。

POR rs17685、POR rs72553971及POR rs2868 177已由Zhang等［12］報道，研究指出這3個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點在122例白種人及美國黑人中與華法林的維持劑量相關(guān)。但是，Tan等［13］并未在317例中國漢族人工心臟機械瓣膜置換術(shù)患者人群中發(fā)現(xiàn)POR rs2868177與其華法林維持劑量相關(guān)性，本研究結(jié)果與其相一致。由于Zhang等的研究對象是白種人及美國黑人男性，且患者為非瓣膜病患者，而本研究與Tan等的研究都針對中國漢族人工心臟機械瓣膜置換術(shù)患者，因而人種、性別差異及不同患病人群的抗凝要求可能導(dǎo)致了這一位點結(jié)果的不一致。

本實驗首次在中國漢族人工心臟機械瓣膜置換術(shù)患者人群中探討POR rs17685的多態(tài)性與華法林維持劑量的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)在該人群中POR rs17685 T突變與華法林劑量上調(diào)相關(guān)。POR rs17685屬于POR的tag SNP，目前，暫未見有關(guān)該位點功能的報道，根據(jù)我們的發(fā)現(xiàn)推測其可能是通過提高POR的自身活性，從而使得CYP2C9的代謝能力增強。然而，相關(guān)機制有待進一步的探討及驗證。今后將更全面地篩查與華法林劑量相關(guān)的因素，構(gòu)建華法林劑量預(yù)測方程并通過臨床應(yīng)用進行驗證，以更好地指導(dǎo)華法林的個體化用藥。

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