青刺果總黃酮對四氧嘧啶致糖尿病小鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響

呂 程，吳小蘭，殷中瓊，景 波，李正文，戴書俊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，四川雅安 625014）

糖尿病腎病 （diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）病人最重要的合并癥之一，它是糖尿病病人致殘、致死的重要原因。如何及時預(yù)防DN發(fā)生，延緩慢性腎衰進程，成為醫(yī)學(xué)界攻克的重點方向。近年來大量研究證明，許多黃酮類化合物在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面療效明顯，如蘆丁、楊梅酮、淫羊藿苷、水飛薊素、硫磺菊素、兒茶素等植物黃酮提取物［1－6］。

青刺果（Prinsepia utilisRoyle）為薔薇科扁核木屬植物總花扁核的果實，我國主要產(chǎn)于四川、西藏、云南、貴州等地區(qū)。前期研究表明青刺總果黃酮（flavonoids fromPrinsepia utilisRoyle，F(xiàn)PR）含有黃酮類、黃酮醇類和查耳酮類［7］，其對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有降血糖和降血脂的作用［8］。因此本實驗用FPR對四氧嘧啶致糖尿病模型小鼠進行干預(yù)，以明確FPR對糖尿病小鼠腎臟是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器 FPR，總黃酮含量306 mg·g－1，由本室從青刺果中提取，臨用前用2 g·L－1的羧甲基纖維素鈉配成15 g·L－1的FPR混懸液；四氧嘧啶（ALX，Sigma公司），臨用前用生理鹽水配成75 g·L－1的注射液。阿卡波糖（AR，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H19990205），臨用前用2 g·L－1的羧甲基纖維素鈉配成1 g·L－1的混懸液。

Lelca切片機（德國）；Nikon生物顯微鏡及照相機（日本）；LKB-Ⅴ型超薄切片機（瑞典）；H-600型投射電鏡（日本）。

1.2 實驗動物 ICR小鼠80只，♂♀各半，體質(zhì)量（23±2）g，分籠飼養(yǎng)，室溫（22±1）℃，相對濕度（60±5）%，自由采食和飲水。

1.2.1 糖尿病模型的建立 小鼠禁食12 h，以200 mg·kg－1的劑量腹腔注射ALX制作DM模型。d 4測空腹血糖，保留血糖值大于10.00 mmol·L－1的小鼠作為DM模型鼠。

1.2.2 動物分組及給藥 將DM模型小鼠隨機分為：模型對照組（DM組）、青刺果總黃酮組（FPR組）、正常組（NC組）、陽性藥物治療組（AR組）。每組20只小鼠，♀♂各半。FPR組以300 mg·kg－1、AR組以 20 mg·kg－1的劑量每天灌胃給藥 1次。DM組和NC組每天灌胃生理鹽水1次，連續(xù)4周，隔天稱重1次。

1.3 樣品的采集和處理 于給藥第2、4周末各處死一半數(shù)量（10只）的小鼠，測血糖并剖腹取腎，測腎重。剝離4周末腎臟的包膜和結(jié)締組織，將腎臟縱向剖開，部分腎置于400 g·L－1多聚甲醛中固定用于做石蠟切片；再取1 mm3大小腎皮質(zhì)置于0.25 mol·L－1的戊二醛中4℃下固定用于做電鏡切片。石蠟切片酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，厚5μm的切片，分別進行HE、PAS和Gomori染色，光鏡下觀察腎臟病理變化。電鏡切片用pH 7.2的磷酸緩沖液清洗后，用0.04 mmol·L－1的四氧化鋨后固定，再用pH 7.2的磷酸緩沖液清洗后，依次用丙酮梯度脫水，然后將脫水組織塊放入Epon環(huán)氧樹脂812與純丙酮以1∶1的混合液置換（40℃溫箱內(nèi)過夜）后，用浸透液浸透，Epon環(huán)氧樹脂812包埋，溫箱中硬化，切片，醋酸雙氧鈾－檸檬酸鉛雙重染色，電鏡下觀察腎臟病理變化。

2 結(jié)果

2．1 FPR對糖尿病小鼠血糖、腎重及腎臟指數(shù)的影響 FPR對DM小鼠血糖、腎重及腎臟指數(shù)的影響見Tab 1。經(jīng)FPR治療的小鼠血糖和腎臟指數(shù)較DM組明顯降低（P＜0.01）。FPR組小鼠的腎重至治療的第二周和第四周均相較于DM組明顯降低（P＜0.05）。但FPR組的腎重和腎臟指數(shù)與NC組和AR組相比無明顯差異。

2.2 青刺果總黃酮對糖尿病小鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響

2.2.1 HE染色 4個實驗組小鼠的腎組織形態(tài)在光鏡下觀察到的HE染色結(jié)果見Fig 1。其中，NC組結(jié)構(gòu)正常（Fig 1-A1）；DM組與NC組比較，腎小球體積明顯增大，腎小球系膜細(xì)胞增多（Fig 1-A2），腎小管上皮細(xì)胞變性、脫落和壞死，蛋白管型形成，間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維細(xì)胞增生（Fig 1-A3）；FPR組與DM組比較，腎小球體積輕微腫大，系膜細(xì)胞輕度增生，腎小管上皮細(xì)胞呈顆粒變性（Fig 1-A4）；AR組的腎小球體積輕微腫大，系膜細(xì)胞輕度增生，間質(zhì)少量纖維細(xì)胞浸潤（Fig 1-A5）。

2.2.2 PAS染色 4個實驗組小鼠的腎組織形態(tài)在光鏡下觀察PAS染色結(jié)果見Fig 2。其中NC組結(jié)構(gòu)正常 （Fig 2-B1）；DM組與NC組比較，腎小球毛細(xì)血管基底膜彌漫性增厚（Fig 2-B2）；腎小管間質(zhì)和腎小管內(nèi)大量糖原沉積 （Fig 2-B3）；與DM組比較，F(xiàn)PR組小鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜較薄，糖原沉積減輕（Fig 2-B4）；AR組基底膜輕度增厚，腎小管內(nèi)未見糖原沉積（Fig 2-B5）。

Fig 1 Effects of FPR on morphology of renal tissues in diabetic m ice by HE stainingobserved under the microscope（×400）

2.2.3 Gomori染色 4個實驗組小鼠的腎組織形態(tài)在光鏡下觀察Gomori染色結(jié)果見Fig 3。其中NC組為正常腎組織 （Fig 3-C1）；DM組與NC組比較，腎小管間質(zhì)纖維化，網(wǎng)狀纖維和膠原纖維明顯增加（Fig 3-C2、3-C3）；FPR組與DM組比較，腎小管間質(zhì)的網(wǎng)狀纖維數(shù)量較少（Fig 3-C4）。AR組腎小管間質(zhì)網(wǎng)狀纖維較少（Fig 3-C5）。

2.2.4 電鏡觀察 4個實驗組小鼠的腎組織形態(tài)在電鏡下觀察結(jié)果見Fig 4。其中NC組腎小球毛細(xì)血管基底膜結(jié)構(gòu)正常，細(xì)長的足突從球囊臟層上皮細(xì)胞表面伸出，貼附于基底膜之外并保持一定的距離 （Fig 4-D1，×17 000）。DM組與 NC組比較，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚并不均勻，足細(xì)胞次級突起融合消失，線粒體基質(zhì)深染（Fig 4-D2，×12 000）；腎小管間質(zhì)處的膠原纖維可見明顯增多（Fig 4-D3，×25 000）；腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)大量空泡形成，線粒體嵴減少或消失，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、邊集（Fig 4-D4，×5 000）。FPR組相較于DM組，腎小球毛細(xì)血管基底膜變薄，足細(xì)胞突起排列整齊（Fig 4-D5，×17 000），腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴較明顯，排列整齊（Fig 4-D6，×20 000）。

Tab 1 Influence of FPR on GLU，kidney weight and renal index of diabeticm ice

Tab 1 Influence of FPR on GLU，kidney weight and renal index of diabeticm ice

renal index＝kidney weight（mg）／body weight（g）；*P＜0．05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Second week GLU／mmol·L－1 Kidney weight／g Renal index／mg·g－1 Fourth week GLU／mmol·L－1 Kidney weight／g Renal index／mg·g－1 NC Group 5.10±0.28 0.34±0.04 12.04±0.94 5.21±0.41 0.42±0.04 13.15±0.48 DM Group 11.32±0.13** 0.45±0.10** 18.99±0.78** 11.38±0.51* 0.51±0.02* 18.90±0.24**FPR Group 8.68±0.62*＃＃ 0.38±0.05＃ 14.89±0.55*＃＃ 7.02±0.39＃＃ 0.42±0.03＃ 13.78±0.49＃＃AR Group 8.42±0.21*＃＃ 0.39±0.09＃ 14.89±0.55*＃＃ 6.80±0.54＃＃ 0.43±0.08＃ 14.37±2.52＃＃

Fig 2 Effects of FPR on morphology of renal tissues in diabetic m ice by PAS staining（×400）

Fig 3 Effects of FPR on morphology of renal tissues in diabeticm ice by Gomori staining（×400）

3 討論

Fig 4 Effects of FPR on morphology of renal tissues in diabetic m ice

實驗結(jié)果表明，F(xiàn)PR可明顯降低血糖，有效控制DM小鼠的腎臟肥大，并且明顯緩解腎臟的各種病理變化，可有效治療糖尿病腎臟病變。早期糖尿病腎臟病變在糖代謝正常后可防止或逆轉(zhuǎn)，血糖控制不良是發(fā)生糖尿病腎臟損害的重要原因。FPR能明顯降低血糖水平，使高糖對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用減弱，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成減少，參與炎性反應(yīng)的物質(zhì)減少［9］，內(nèi)皮生長因子水平降低［10］，轉(zhuǎn)化生長因子 β（TGF-β）［11－12］分泌減少，糖尿病腎臟的血管損傷、腎小球硬化和纖維化降低和緩解。并且FPR還可通過降低血糖，來對抗高糖刺激產(chǎn)生的活性氧簇（ROS）［13－14］的明顯增加。在糖尿病狀態(tài)下，腎皮質(zhì)線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激的增加可能是造成DM小鼠腎臟足細(xì)胞足突的消失、融合，足細(xì)胞數(shù)量減少的原因之一。本研究證明了FPR能有效維持DM小鼠腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，即FPR通過維護腎小球濾過屏障的完整性，減少蛋白尿的排出，從而保護了DM小鼠的腎臟。

綜上所述，F(xiàn)PR能明顯減輕DM小鼠腎組織病變，有效改善DM引起的腎臟的損傷，對DM小鼠腎具有保護作用。

參考文獻：

［1］ Hao H H，Shao ZM，Tang D Q，et al.Preventive effects of rutin on the development of experimental diabetic nephropathy in rats［J］.Life Sci，2012，91：959－67.

［2］ Ozcan F，Ozmen A，Akkaya B，et al.Beneficial effect ofmyricetin on renal functions in streptozotocin-induced diabetes［J］.Clin Exp Med，2012，12：265－72.

［3］ Qi M Y，Chen K，Liu H R，et al.Protective effect of Icariin on the early stage of experimental diabetic nephropathy induced by streptozotocin via modulating transforming growth factorβ1 and typeⅣ collagen expression in rats［J］.JEthnopharmacol，2011，138：731－6.

［4］ Giovanni L V，Salvatore S，Valeria S，etal.Effect of silibinin on endothelial dysfunction and ADMA levels in obese diabetic mice［J］.Cardiovasc Diabetol，2011，10：62.

［5］ Song M Y，Jeong G S，Kwon K B，et al.Sulfuretin protects against cytokine-inducedβ-cell damage and prevents streptozotocininduced diabetes［J］.Exp Mol Med，2010，42（9）：628－38.

［6］ Chennasamudram SP，Kudugunti S，Boreddy P R，et al.Renoprotective effects of（＋）-catechin in streptozotocin-induced diabetic ratmodel［J］.Nutr Res，2012，32：347－56.

［7］ 詹素瓊，袁定勝，李旭廷，等.青刺果總黃酮定性分析及含量測定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（28）：15580－2，5.

［7］ Zhan SQ，Yuan D S，Li X T，etal.Identification and determination of total flavonoids from Prinsepia utilis Royle［J］.J Anhui Agri Sci，2010，38（28）：15580－2，5.

［8］ 賈仁勇，殷中瓊，吳小蘭，等.青刺果黃酮對四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的降糖作用［J］.中藥材，2008，31（3）：399－403.

［8］ Jia R Y，Yin Z Q，Wu X L，et al.Hypoglyceminc effect of flavonoids from Prinsepia utilison alloxan-induced diabeticmice［J］.JChin Med Mat，2008，31（3）：399－403.

［9］ Pan Q，Yang X H，Cheng Y X.AngiotensinⅡstimulates MCP-1 production in rat glomerular endothelial cells via NAD（P）H oxidase-dependent nuclear factor-kappa B signaling［J］.Braz JMed Biol Res，2009，42：531－6.

［10］Li Z D，Bork JP，Krueger B，et al.VEGF induces proliferation，migration，and TGF-beta1 expression in mouse glomerular endothelial cells viamitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol3-kinase［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，334：1049－60.

［11］Li JH，Huang X R，Zhu H J，et al.Role of TGF-βsignaling in extracellularmatrix production under high glucose conditions［J］.Kidney Int，2003，63：2010－9.

［12］Wang A，Ziyadeh FN，Lee E Y，etal.Interferencewith TGF-beta signaling by Smad3-knockout in mice limits diabetic glomerulosclerosis without affecting albuminuria［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，293：1657－65.

［13］Wai H T，Kathleen A M，John H.Aldose reductase，oxidative stress，and diabeticmellitus［J］.Front Pharmacol，2012，3：87.

［14］呂 翠，劉洪娟，劉曉麗，等.晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及其抑制劑的研究進展［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（4）：452－6.

［14］LüC，Liu H J，Liu X L，et al.The research progress on RAGE and RAGE inhibitor［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（4）：452－6.