沒食子酸誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡機(jī)制的探討

李沐涵，王明艷，趙鳳鳴，陳海彬，周紅光，趙青春，李文婷，吳勉華

（南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210023）

原發(fā)性肝癌是世界上死亡率第三的惡性腫瘤，由于我國大量乙型肝炎感染人群的存在，肝癌在我國高發(fā)［1］。目前，肝癌治療手段是以手術(shù)和化學(xué)治療為主的綜合治療。這些療法確切，效果明顯，但受確診時間、肝功能、腫瘤數(shù)目和有無血管、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素的制約和影響，導(dǎo)致肝癌患者整體預(yù)后差，平均存活時間短。近年來，中藥治療腫瘤因其獨(dú)特的優(yōu)勢越來越多地引起人們的重視，尋找能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的中藥或提取物已成為當(dāng)前研究腫瘤治療的熱點(diǎn)之一。沒食子酸（gallic acid，GA）是一種有機(jī)酸，化學(xué)名是3，4，5-三羥基苯甲酸，是山茱萸［2］、大黃［3］、桑螵蛸［4］等多種天然中草藥的主要成分。實(shí)驗(yàn)研究表明，GA可以抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，對腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用［5］。本文研究GA體外對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖抑制活性、凋亡相關(guān)基因p53表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為GA用于臨床抗腫瘤治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 GA購自中國藥品生物制品檢定所（純度 ＞99%，批號：110831-201002），用 RPMI 1640（26800-020，Gibco公司）配置成濃度為 1 mmol·L－1的母液儲存液，0.22μm過濾除菌，分裝、避光保存于 －20℃冰箱；MTT（M2108，Sigma）溶于 PBS中，濃度為5 g·L－1，4℃避光保存于冰箱，1周棄用；小牛血清（20110809，杭州四季青公司）；胰蛋白酶、青、鏈霉素雙抗液、DMSO、TRIzol Reagent、RT-PCR試劑盒均購自美國 Sigma公司；人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、Annexin V-FITC／PI、Hoechst 33258檢測試劑盒等，均購自于南京凱基生物公司；p53 mRNA由上海生工合成，一抗p53（1∶1 000，Cell Signaling）。

1.2 儀器 倒置顯微鏡和電鏡購自日本Olympus公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、高速冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀、PCR儀、Western blot曝光儀均購自于 Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱（SANYO MCO175，日本三洋公司）；流式細(xì)胞儀（CLOUTER EPICS-XL，美國 Beckmancoulter公司）；細(xì)胞超凈工作臺（JJT-900／1300，蘇州凈化公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721體外接種于RPMI 1640完全培養(yǎng)液（內(nèi)含有10%小牛血清，100 kU·L－1的青霉素和鏈霉素），置于溫度37℃，CO25%，濕度為95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞的融合率為70%～80%，指數(shù)生長期時進(jìn)行傳代，接種細(xì)胞密度為 2×106·L－1。

2．2 M TT法檢測 GA對細(xì)胞增殖的影響 將SMMC-7721細(xì)胞以每孔180μl接種于96孔板中，加入 GA 20μl，終濃度分別為 0（對照組）、3.125、6.25、12.5、25、50μmol·L－1，每個藥物濃度組各設(shè)6個平行復(fù)孔。分別作用24、48、72 h后加入MTT 10μl（5 g·L－1），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育 4 h后離心，棄上清液，每孔均加入DMSO 150μl，震蕩混勻10 min后，置于酶標(biāo)儀于490 nm波長處測每空吸光度（OD）值。計算抑制率IR（%）：IR／%＝（1－OD處理組／OD對照組）×100%，并采用Bliss法計算半數(shù)抑制濃度（IC50），為以下實(shí)驗(yàn)GA劑量選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 取指數(shù)生長期細(xì)胞加入GA，使其終濃度分別為0（對照組）、6.25、12.5、25μmol·L－1，作用 48 h，倒置顯微鏡下觀察每組SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

2.4 透視電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取指數(shù)生長期細(xì)胞加入 GA，使其終濃度為 25μmol·L－1，對照組加等體積的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，消化、離心、收集細(xì)胞，用戊二醛與鋨酸固定液固定細(xì)胞，乙醇脫水，LR White樹脂滲透包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。

2．5 Annexin V-FITC／PI檢測凋亡 培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞，分別加入 GA，使其終濃度為0（對照組）、6.25、12.5、25μmol·L－1，于 GA作用 48 h，消化、分離、收集細(xì)胞，加入500μl binding buffer和5 μl Annexin V-FITC，5μl碘化丙啶（PI），避光染色15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2．6 RT-PCR檢測GA對p53 m RNA表達(dá)的影響將4組藥物濃度（0、6.25、12.5、25μmol·L－1）的GA作用細(xì)胞48 h后，用 TRIzol Reagent提取總RNA，紫外分光光度計準(zhǔn)確定量每組mRNA純度及含量，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。p53引物設(shè)計為：P1：5′-GCT GCT CAG ATA GCG ATG G-3′；P2：5′-CAG GAC AGG CAC AAA CAC G-3′；同時以 GAPDH為內(nèi)參照，GAPDH的引物設(shè)計為 P1：5′-GCC TCA AGA TCA TCA GCA A-3′；P2：5′-CCA GCG TCA AAG GTG GAG-3′。PCR轉(zhuǎn)錄條件是① p53：95℃5min→95℃變性30 s，53℃退火 1 min，72℃延伸 1 min 30循環(huán)，→72℃10 min，end；② 內(nèi)參 GAPDH：94℃ 2 min→94℃變性 30 s，62℃退火 1 min，72℃延伸 1 min 30循環(huán)→72℃10 min，end。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2．7 W estern blot技術(shù)檢測p53蛋白表達(dá) 將4組（0、6.25、12.5、25μmol·L－1）GA，分別作用細(xì)胞48 h后，低溫提取細(xì)胞蛋白，Brandford法測定蛋白濃度，以30μg質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)上樣，采用10%的分離膠 SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉，在4℃中按1∶1 000濃度孵育一抗過夜，洗滌，按1∶3 000濃度室溫孵育二抗2 h，充分洗滌，加ECL顯影液，將膜置于曝光儀中曝光，分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以表示，各組數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3．1 GA對SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制作用 MTT法檢測結(jié)果顯示，不同劑量組 GA：3.125、6.25、12.5、25、50μmol·L－1分別作用于 SMMC-7721細(xì)胞24、48、72 h后，均能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且呈明顯的劑量依賴性，各組抑制率見Tab 1。由Tab 1可看出，GA作用24 h抑制增殖不及48、72 h；48 h的半數(shù)抑制率 IC50為（11.8±1.06）μmol·L－1、72 h的半數(shù)抑制率 IC50為（11.5±0.06）μmol·L－1。各組時間比較，以48 h作用明顯，故以48 h時間段，做深入實(shí)驗(yàn)研究。

Tab 1 Inhibitory effect of GA on SMMC-7721

Tab 1 Inhibitory effect of GA on SMMC-7721

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Group Concentration／μmol·L－1 Inhibition rate／%24 h 48 h 72 h Control 0－－－Gallic acid 3.125 3.1±1.01 16.1±1.09 11.1±1.07 6.25 8.2±1.03 32.8±2.10**10.2±1.01 12.5 10.1±1.05*51.6±2.04**52.1±1.01*25 15.1±1.08*85.1±2.04**89.3±1.04*50 20.2±1.03*98.1±1.02**98.1±1.05*

3．2 GA對SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響 不同劑量GA：0（對照組）、6.25、12.5、25μmol·L－1分別作用于SMMC-7721細(xì)胞48 h后，在倒置顯微鏡下觀察放大200倍細(xì)胞的生長形態(tài)，如Fig 1所示。由Fig 1A可見，對照組SMMC-7721細(xì)胞排列緊密、呈現(xiàn)復(fù)層、貼壁生長旺盛，細(xì)胞多為不規(guī)則多邊形，細(xì)胞胞質(zhì)透明，細(xì)胞膜邊緣清晰。在經(jīng)過不同濃度GA作用后，細(xì)胞形態(tài)隨著藥物劑量的增加，呈劑量依賴性變化，數(shù)目遞減，細(xì)胞在高濃度25μmol·L－1時，由Fig 1D可見細(xì)胞呈現(xiàn)整體萎縮，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，細(xì)胞膜邊緣出現(xiàn)小氣泡等凋亡形態(tài)改變。

Fig 1 M orphologic change of SMMC-7721 cells by inverted m icroscope（×20）A：Control group；B：Treated with 6.25μmol·L－1 GA；C：Treated with 12.5μmol·L－1 GA；D：Treated with 25μmol·L－1 GA

3．3 GA作用SMMC-7721細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化如Fig 2所示，正常的細(xì)胞核較大，核仁明顯，細(xì)胞器豐富，尤其是線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體圓形或橢圓形；基質(zhì)豐富，在細(xì)胞內(nèi)部一處聚集，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻（Fig 2A）。而當(dāng)GA劑量為25μmol·L－1時，微絨毛脫落，線粒體腫脹，胞質(zhì)變性，出現(xiàn)空泡，核膜固縮邊聚，部分有破損，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的中晚期凋亡形態(tài)改變（Fig 2B）。

Fig 2 The ultrastructural change of SMMC-7721 cells by transm ission electron m icroscopeA：Control group（×3 000）；B：Treated with 25μmol·L－1 GA（×5 000）

3．4 GA誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡 用Annexin V-FITC／PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的GA作用SMMC-7721細(xì)胞48 h后，各給藥組與對照組（0μmol·L－1GA）相比，細(xì)胞凋亡率均明顯增加，且呈劑量依賴性，說明GA能明顯誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡（Fig 3，Tab 2）。Fig 3中，左上限Q1為細(xì)胞晚期壞死率，右上限Q2為細(xì)胞晚期凋亡和早期壞死率，左下限Q3為正常細(xì)胞，右下限Q4為早中期細(xì)胞凋亡率。

Fig 3 Apoptotic rate of SMMC-7721 cells treated with GA for 48h detected by Annexin V-FITC／PI double-stainingA：Controlgroup；B：Treated with 6.25μmol·L－1 GA；C：Treated with 12.5μmol·L－1 GA；D：Treated with 25μmol·L－1 GA

Tab 2 Effect of GA on apoptosis of SMMC-7721 cells

Tab 2 Effect of GA on apoptosis of SMMC-7721 cells

**P＜0.01 vs control group

Group Concentration／μmol·L－1Apoptotic rate／%Control 0 7.6±1.01 Gallic acid 6.25 17.2±1.09**12.5 41.6±2.03**25 87.1±1.06**

3．5 GA對SMMC-7721細(xì)胞p53 m RNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示：用藥組p53 mRNA條帶灰度隨著濃度增加而加深，各劑量組和內(nèi)參GAPDH做比較，數(shù)據(jù)分析顯示，各劑量組均能升高p53 mRNA的表達(dá)，且呈劑量依賴性，反映了GA明顯上調(diào)肝癌細(xì)胞SMMC-7721 p53 mRNA的表達(dá)（Fig 4，Tab 3）。

Fig 4 Expression of p53 m RNA in SMMC-7721 cells by RT-PCRA：Control group；B：Treated with 6.25μmol·L－1 GA；C：Treated with 12.5μmol·L－1 GA；D：Treated with 25μmol·L－1 GA

Tab 3 Expression of p53 mRNA in SMMC-7721 cell

Tab 3 Expression of p53 mRNA in SMMC-7721 cell

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Group Concentration／μmol·L－1p53／GAPDH mRNA Control 0 －Gallic acid 6.25 0.23±0.03*12.5 0.65±0.04*25 0.78±0.01**

3．6 GA對SMMC-7721細(xì)胞p53蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，用終濃度為6.25、12.5、25μmol·L－1GA預(yù)處理細(xì)胞48 h，p53蛋白條帶灰度逐漸加深。圖像分析結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，p53蛋白表達(dá)升高（Fig 5，Tab 4），提示GA能上調(diào)肝癌細(xì)胞SMMC-7721 p53基因蛋白的表達(dá)。

Fig 5 Expression of p53 protein in SMMC-7721 cells by W estern blotA：Control group；B：Treated with 6.25μmol·L－1 GA；C：Treated with 12.5μmol·L－1 GA；D：Treated with 25μmol·L－1 GA

Tab 4 Expression of p53 protein in SMMC-7721 cells

Tab 4 Expression of p53 protein in SMMC-7721 cells

*P＜0.05 vs control group

Group Concentration／μmol·L－1 p53／β-actin protein Control 0 0.18±0.02 Gallic acid 6.25 0.34±0.01*12.5 0.61±0.01*25 0.89±0.02*

4 討論

GA是一種廣泛存在于多種天然中草藥中的化學(xué)成分，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，GA對多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，且具有低毒性，可作為一種潛在的阻止腫瘤發(fā)生的化學(xué)預(yù)防劑［6］。研究表明，GA的抗腫瘤機(jī)制包括：使細(xì)胞停滯生長于某一期，Veluri等［7］研究發(fā)現(xiàn)，GA可使前列腺癌DU145細(xì)胞阻滯在S期，阻止腫瘤細(xì)胞的生長。同時發(fā)現(xiàn)，GA可激活caspase-3，上調(diào) Cip1／p21、caspase-9、caspase-3等基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡。李沐涵等［8］研究發(fā)現(xiàn)，GA能促進(jìn)人胃癌細(xì)胞MGC-803的凋亡。Hsu等［9］發(fā)現(xiàn)，GA可以通過觸發(fā)Fas以及線粒體凋亡通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

大多數(shù)抗腫瘤藥物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的，形態(tài)改變是判斷凋亡的基礎(chǔ)，如出現(xiàn)線粒體腫脹，胞質(zhì)變性，核染色質(zhì)凝集、固縮，甚至出現(xiàn)凋亡小體等［10］。本實(shí)驗(yàn)中，倒置顯微鏡和電鏡結(jié)果顯示出明顯的凋亡現(xiàn)象；通過Annexin V-FITC／PI雙染法證實(shí)GA可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，且隨著劑量的升高，凋亡率增大，呈劑量依賴性。

細(xì)胞凋亡是由眾多基因調(diào)控的復(fù)雜的程序性死亡過程，如 bcl-2、caspase-3、p53、Fas等通過其自身蛋白產(chǎn)物發(fā)揮調(diào)控凋亡的作用［11－12］。有研究表明，p53基因是一種重要的凋亡相關(guān)基因，分為兩種類型：野生型（wp53）和突變型（mp53），人類一半以上腫瘤疾病或者是缺少p53蛋白，或者是在這條基因上發(fā)生突變［13］。其中，突變型p53基因可以促進(jìn)細(xì)胞生長，參與多種腫瘤的發(fā)生。野生型p53是最重要的腫瘤抑制因子，又叫抑癌p53基因，主要功能是參與細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)控，限制細(xì)胞生長分裂，存在于正常細(xì)胞核中，對細(xì)胞損傷分化有抑制作用，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［14］。Ventura等［15］研究表明，野生型p53在帶有缺陷p53的小鼠腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、衰老以及細(xì)胞凋亡等途徑而引起腫瘤的明顯消除。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證GA誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究抑癌p53基因，用RTPCR和Western blot法檢測SMMC-7721細(xì)胞在經(jīng)過不同濃度GA作用后，p53 mRNA和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果表明，GA能明顯提高SMMC-7721細(xì)胞中抑癌基因p53的表達(dá)，推測GA誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與促進(jìn)抑癌基因p53的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，GA對肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖有一定的抑制作用，其中在48 h的抑制增殖活性最強(qiáng)，其抗腫瘤活性可能與GA促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡有關(guān)，該凋亡作用可能是通過上調(diào)抑癌基因p53的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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