脂聯(lián)素通過(guò)增強(qiáng)糖尿病大鼠心肌缺血／再灌注損傷后心肌抗氧化能力減少細(xì)胞凋亡

郭 佳，邊云飛，肖傳實(shí)，李志東

（山西醫(yī)科大學(xué)1.第一醫(yī)院心內(nèi)科、2.第二醫(yī)院心內(nèi)科、3.藥理學(xué)教研室，山西太原 030001）

臨床研究顯示，合并糖尿病的人群心肌梗死發(fā)病率及死亡率遠(yuǎn)高于單純心肌梗死病人［1－2］，如何保護(hù)糖尿病患者缺血／再灌注損傷已成為研究熱點(diǎn)。已有研究表明脂聯(lián)素（adiponectin，APN）對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，但APN對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血／再灌注損傷的作用效應(yīng)及其機(jī)制尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究APN對(duì)鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）所致實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠心肌缺血／再灌注損傷的影響，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 APN：Sigma，SRP4593；STZ：Sigma，S0130；血糖試紙：上海榮盛生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）定量測(cè)試盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）購(gòu)自 Vigorous Biotechnology公司。小動(dòng)物呼吸機(jī)及多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)：購(gòu)自成都泰盟科技有限公司，型號(hào)分別為 HX-100E和RM6240BD；電泳儀：購(gòu)自北京六一儀器廠；熒光顯微鏡：日本Olympus公司。

1.1.2 動(dòng)物及分組 ♂清潔級(jí)Sprague Dawley（SD）大鼠，（220～250）g，70只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SD大鼠被隨機(jī)分為5組，即正常組（NS）、IR組（NIR）、糖尿病組（DS）、DS＋I(xiàn)R組（DIR）、DS＋I(xiàn)R＋APN組（APN）。APN預(yù)處理組于再灌注前10 min經(jīng)舌靜脈給予APN（1μg·kg－1），其余各組注射等量生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖尿病模型的建立 大鼠腹腔注射STZ 55 mg·kg－1，普通飼料喂養(yǎng)3周，所有大鼠禁食4 h后斷尾取血，測(cè)定空腹血糖，空腹血糖＞16.7 mmol·L－1，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿表現(xiàn)者為糖尿病模型動(dòng)物。此后，普食飼養(yǎng)3周后制備心肌I／R模型。

1.2.2 心肌I／R損傷模型制備 2%戊巴比妥鈉0.2 ml／100 g麻醉大鼠，仰臥位固定。記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，經(jīng)氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，開(kāi)胸暴露心臟，采用5／0線于左心耳根部下方結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心電圖示R波明顯增高伴ST段即刻抬高，說(shuō)明心肌已缺血。45min后復(fù)灌心肌，抬高的ST段明顯回落為再通標(biāo)志，并持續(xù)3 h。

1.2.3 血糖和體重測(cè)定 各組大鼠分別于注射STZ前、注射后3 d、1周、2周和3周測(cè)定空腹血糖及體重，并與造模前作比較。

1.2.4 心肌梗死面積測(cè)定 再灌注3 h后，重新結(jié)扎左前降支，經(jīng)頸動(dòng)脈注入2%伊文氏藍(lán)染液1 ml。快速取出心臟，生理鹽水沖洗，并從左心室底部開(kāi)始切片，觀察，藍(lán)色區(qū)域?yàn)槲慈毖獏^(qū)、紅色區(qū)域?yàn)槿毖獏^(qū)。將紅色區(qū)域置于TTC磷酸緩沖液37℃孵育10 min后，紅色為缺血但未梗死心肌，灰白色為梗死心肌。心梗面積和缺血區(qū)面積采用Image-Pro Plus軟件分析，心梗面積用梗死面積／缺血區(qū)域×100%表示。

1.2.5 心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定 再灌注3 h后，取左心室游離壁心肌組織固定、切片、石蠟包埋，置于包被有多聚賴氨酸的載玻片上。TUNEL反應(yīng)液加于切片上，37℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡下，正常細(xì)胞呈紫藍(lán)色，TUNEL陽(yáng)性為棕褐色。每個(gè)心臟觀察3張切片，每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比表示。

1.2.6 心肌氧化、抗氧化物質(zhì)檢測(cè) 再灌注結(jié)束后，迅速取左心室缺血區(qū)心肌組織，制備組織勻漿，SOD、NO和MDA含量檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.7 ROS測(cè)定 取左心室游離壁心肌組織切片，將DHE稀釋后滴于組織上，37℃ 濕盒避光孵育30 min。熒光顯微鏡觀察和拍攝圖像，用圖像分析軟件Image Pro Plus分析熒光強(qiáng)度變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用ˉx±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用HSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、血糖的變化 同非糖尿病組相比，注射STZ造模后，大鼠血糖明顯升高，體重明顯降低（P＜0.05）。糖尿病模型組間大鼠的體重、血糖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（Fig 1）。

Fig 1 Body weight and blood glucose at designated time point±s）A：Blood glucose level at designated time points；B：Weight at designated time points.*P＜0.05 vs NS，n＝10－12／group.

2.2 心肌梗死面積 NS組和DS組心梗面積為0。與NS組及DS組相比，NIR組及DIR組心梗面積明顯增加（P＜0.01），APN預(yù)處理可明顯減少糖尿病缺血／再灌注心梗面積（P＜0.05）（Fig 2）。

2.3 各組心肌組織中的細(xì)胞凋亡情況

2.3.1 TUNEL染色 TUNEL染色結(jié)果顯示：NIR組和DIR組明顯增加心肌細(xì)胞凋亡，APN預(yù)處理減少糖尿病缺血／再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡（Fig 3）。

Fig 2 Infarct size ofmyocardial tissue at theend of reperfusion±s，n＝6）A：Representative image of rat hearts stained with Evan’s blue-TTC.B：Infarct size.**P＜0.01 vs NS；＃＃P＜0.01 vs DS；ΔP＜0.05 vs DIR.

Fig 3 Rate of apoptosis in cardiac tissues of rats detected by TUNEL staining（s）**P＜0．01 vs NS；＃＃P＜0.01 vs DS；ΔP＜0.05 vs DIR

2.3.2 caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) NIR組及DIR組分別較各自的對(duì)照NS組及DS組相比，Bax、caspase 3蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)減少；而APN可明顯增加糖尿病缺血／再灌注心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)，減少Bax和caspase-3表達(dá)（Fig 4）。

Fig 4 W estern blot analysis of Bcl-2，Bax and caspase-3 in rat cardiom yocyte（ˉx±s，n＝3）*P＜0.05 vs NS；＃P＜0.05 vs DS；ΔP＜0.05 vs DIR

Fig 5 ROS production in rat cardiom yocyte

2．4 心肌SOD、MDA、NO的變化 NIR組和DIR組心肌組織SOD及NO活性明顯低于各自的對(duì)照NS組和DS組，MDA含量高于NS組和DS組（P＜0.01），而且DIR組上述指標(biāo)變化較NIR組更明顯；APN預(yù)處理可明顯升高糖尿病缺血／再灌注心肌組織SOD及 NO活性，降低 MDA含量 （P＜0.05）（Tab 1）。

Tab 1 SOD，MDA，NO in rat cardiom yocyte±s，n＝6）

Tab 1 SOD，MDA，NO in rat cardiom yocyte±s，n＝6）

**P＜0.01 vs NS，＃＃P＜0.01 vs DS；ΔP＜0.05 vs DIR

Group SOD kU·g－1 Pro MDA μmol·g－1 Pro NO μmol·g－1Pro NS 62.24±4.63 2.94±0.28 1.89±0.05 NIR 45.01±3.89**10.45±0.34**0.77±0.09**DS 50.60±3.12 9.53±0.74 1.45±0.06 DIR 33.63±6.05＃＃ 15.22±1.37＃＃ 0.49±0.08＃＃APN 58.19±5.77Δ 3.64±0.45Δ 0.88±0.07Δ

2．5 APN對(duì)ROS的影響 如Fig 5所示，NIR組和DIR組心肌組織ROS的生成較各自的對(duì)照NS組和DS組增多，APN預(yù)處理可減少ROS生成。

3 討論

經(jīng)皮冠脈介入治療技術(shù)已成為缺血性心臟病再灌注治療的理想方法，然而，缺血心肌再灌注后可出現(xiàn)心肌缺血／再灌注損傷（myocardial ischemia and reperfusion injury，MIRI）。MIRI導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)障礙、心功能異常、心肌細(xì)胞壞死和凋亡，嚴(yán)重危害患者的生命［3－4］。糖尿病作為冠心病的等危癥，其急性心肌梗死的發(fā)病率是非糖尿病人群的3～4倍，而并發(fā)急性心肌梗死的糖尿病患者再灌注治療后發(fā)生MIRI的比例明顯升高［5］，因此，對(duì)該人群的保護(hù)就顯得尤為重要。

APN是由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、高血壓、冠心病等疾病患者APN水平明顯降低，提示 APN具有心臟保護(hù)作用［6－8］。有報(bào)道證實(shí)MIRI模型鼠，其缺血／再灌注損傷越嚴(yán)重，APN水平減少越明顯。使用APN基因敲除鼠，誘導(dǎo)MIRI，可見(jiàn)敲除鼠心肌梗死范圍明顯擴(kuò)大，細(xì)胞凋亡和TNF-α表達(dá)增加；采用腺病毒介導(dǎo)APN轉(zhuǎn)染可減少梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡及 TNF-α表達(dá)［9］。我們的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，APN通過(guò)減少心肌酶、升高 SOD和 NO活力有效減輕 MIRI［10－11］。本實(shí)驗(yàn)采用STZ誘導(dǎo)構(gòu)建糖尿病大鼠模型，并對(duì)糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行I／R，結(jié)果表明，APN預(yù)處理組糖尿病大鼠MIRI較未處理組明顯減輕，表現(xiàn)在心肌梗死范圍縮小，心肌細(xì)胞凋亡減少，證實(shí)APN對(duì)STZ所致的實(shí)驗(yàn)性糖尿病MIRI具有保護(hù)作用。

最近研究證實(shí)［12］，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。心肌缺血／再灌注后會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS可導(dǎo)致生物膜的脂質(zhì)雙分子層發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，使其活性降低甚至喪失，造成心肌損傷；ROS又可損害線粒體膜，繼而啟動(dòng)凋亡程序caspase-3活化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損。糖尿病患者本身就存在有氧化應(yīng)激，由再灌注后產(chǎn)生的過(guò)量的ROS又進(jìn)一步加重了氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致心肌損傷的程度加重［13］。近年來(lái)研究表明合并有糖尿病的MIRI，再灌注導(dǎo)致大量的氧自由基釋放，使得血液和心肌組織中SOD和NO等抗氧化物質(zhì)減少，MDA等氧化物質(zhì)增多，進(jìn)一步加重MIRI損傷［14］。SOD活力可用來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體清除氧自由基的能力，MDA間接反映組織細(xì)胞受損程度。通過(guò)檢測(cè)心肌組織ROS生成、MDA含量及SOD、NO活力反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)APN在減小糖尿病大鼠MIRI心梗范圍和減少心肌細(xì)胞凋亡的同時(shí)，還可以增強(qiáng)SOD和NO活性，減少M(fèi)DA含量和ROS生成，提示APN對(duì)糖尿病大鼠MIRI具有保護(hù)作用，其原因與改善抗氧化系統(tǒng)的防御功能、抑制氧化損傷，維持機(jī)體的氧化與抗氧化平衡有關(guān)。

綜上所述，APN預(yù)處理能夠減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠缺血／再灌注損傷，其機(jī)制可能與減輕氧化損傷有關(guān)。外源性給予APN可以減輕糖尿病心肌缺血／再灌注損傷，這為糖尿病及其并發(fā)癥治療提供了新的思路。

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