微波協(xié)同酶法提取蛹蟲草基質多糖工藝的優(yōu)化研究

汪振炯，王仁雷，吳雨龍，周 峰，華 春，* ，顧忠美，曹志敏，何 盟，陳曉鵬，3

(1.南京曉莊學院生物化工與環(huán)境工程學院，江蘇南京211171;2.江蘇第二師范學院，江蘇南京210013;3.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京210046)

蛹蟲草(Cordyceps militaris)，又名北冬蟲夏草，與著名的中藥材冬蟲夏草(Chinese Caterpillar Fungus)歸為同一個屬。蛹蟲草是蟲菌結合的中藥材，其菌體內含有多種生物活性成分，可與冬蟲夏草相媲美［1］。蛹蟲草可以人工栽培，目前從大米、高粱米、小米、玉米渣等多種基質上均可培養(yǎng)出蛹蟲草子實體［2－3］。但是，在蛹蟲草的規(guī)模化栽培中發(fā)現，蛹蟲草的人工栽培需要消耗大量的人力物力，產量不高，并且在其栽培后會有大量的廢基質產生，通常被當作廢物扔掉。而這些廢基質中含有大量蛹蟲草菌絲體，造成寶貴資源浪費。

蟲草多糖是蛹蟲草菌絲體中含量最多的藥理活性物質，大量研究表明，蟲草多糖有著多種生物活性功能，如具有抗腫瘤、降血糖、抗肝纖維化，抗氧化活性，抗菌活性等作用，并可增強單核巨嗜細胞系統(tǒng)的功能，提高免疫力，治療肝病毒性感染等［4－5］，具有廣闊的開發(fā)前景。因此，從蟲草的廢棄培養(yǎng)基中提取蛹蟲草多糖，對提高蛹蟲草人工栽培的附加值和生產保健食品和藥品等具有重要意義。

隨著現代分離技術的發(fā)展，超聲、微波和生物酶技術在多糖等生物活性物質提取工藝中的應用得到廣泛的關注，且有不少報道［6－8］。目前，國內外有關蛹蟲草培養(yǎng)基中蟲草基質多糖的提取報道，多集中于傳統(tǒng)的水浴提取法，亦有微波和超聲波助提等［9－12］。本文采用微波協(xié)同酶法提取基質多糖，利用酶降解、破壞菌絲體細胞壁，并采用微波促使多糖成分溶出，提高多糖的得率，并對其提取工藝進行了優(yōu)化，以期提高基質多糖得率，為蛹蟲草基質多糖的進一步純化和活性研究奠定基礎，同時也為蛹蟲草保健食品的開發(fā)提供一條新的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂蛹蟲草培養(yǎng)基基質，過60目篩 海安泓壽生物技術有限公司;纖維素酶(酶比活力50000U/g)江蘇銳陽生物科技有限公司;硫酸(CP)無錫市晶科化工有限公司;無水乙醇(AR)國藥集團化學試劑有限公司;苯酚(AR)汕頭市西隴化工廠有限公司。

紫外－可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HH－4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;PHS－3C型pΗ計 上海精密科學儀器有限公司;格蘭仕微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器有限公司;Centrifuge 5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司，上海安亭科學儀器廠;旋轉蒸發(fā)器RE－3000 上海亞榮生化儀器廠;SHZ－111型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝 準確稱取脫脂蟲草基質粉末1g→緩沖液調pH→纖維素酶酶解→滅酶冷卻→微波提取→冷卻→過濾后得上清液→濃縮→加4倍體積90%乙醇于4℃冰箱靜置12h→離心(4600r/min，10min)→收集沉淀→真空干燥得蛹蟲草粗多糖。

1.2.2 多糖含量測定及得率計算 采用苯酚－硫酸法測定蛹蟲草多糖含量［13］。

葡萄糖標準曲線的繪制:精確稱取105℃干燥恒重的葡萄糖100mg，置100mL容量瓶中定容。準確稱取標準溶液 20、40、60、80、100、120、140μL，分置于比色管中，各補加蒸餾水至體積為2.0mL，再分別加入5%的苯酚1.0mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0mL，充分搖勻后靜置30min，補充濃硫酸至刻度，以蒸餾水為空白對照，于波長490nm處測定吸光度以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，并求出回歸方程并計算其標準曲線回歸方程:y=6.0845x+0.0121，R2=0.9939。

多糖得率的計算:粗多糖得率以1g干品中提取出來的粗多糖總量的百分含量表示，計算公式如下:

蟲草多糖得率(%)=多糖的質量/培養(yǎng)基基質樣品干物質的質量×100

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 料液比對多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解時間40min、酶解體系pH5.5、微波功率480W、微波時間 3min 的條件下，料液比依次為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 下提取，測定其在 490nm 下的吸光度，并計算得率，實驗重復3次。

1.2.3.2 酶添加量對多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、酶解溫度50℃、酶解時間40min、酶解體系 pH5.5、微波功率480W、微波時間3min的條件下，纖維素酶用量依次為 500、1000、1500、2000、2500、3000U/g 下提取，測定其在 490nm下的吸光度，并計算得率，實驗重復3次。

1.2.3.3 酶解pH對多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解時間40min、微波功率480W、微波時間3min的條件下，酶解體系 pH 分別為3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5下提取，測定其在490nm下的吸光度，并計算得率，實驗重復3次。

1.2.3.4 酶解溫度對多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解體系pH5.5、酶解時間40min、微波功率480W、微波時間3min的條件下，酶解溫度依次為35、40、45、50、55、60、65℃下提取，測定其在490nm下的吸光度并計算得率，實驗重復3次。

1.2.3.5 酶解時間對多糖提取的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解體系pH5.5、微波功率480W、微波時間3min的條件下，酶解時間依次為10、20、30、40、50、60min下提取，測定其在490nm下的吸光度并計算得率，實驗重復3次。

1.2.3.6 微波功率對多糖得率的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解體系pH5.5、酶解時間40min，微波時間3min的條件下，微波功率依次為320、400、480、560、640、720、800W 下提取，測定其在 490nm 下的吸光度并計算得率，實驗重復3次。

1.2.3.7 微波處理時間對多糖得率的影響 以蒸餾水為提取液，在料液比為1∶30、纖維素酶用量1500U/g、酶解溫度50℃、酶解時間40min、酶解體系pH5.5、微波功率480W的條件下，微波時間依次為1、2、3、4、5、6min下提取，測定其在490nm下的吸光度并計算得率，實驗重復3次。

1.2.4 響應面法優(yōu)化提取工藝 在單因素實驗的基礎上，選取纖維素酶用量、酶解時間、微波功率、微波處理時間4個因素作為自變量，并分別以多糖得率作為響應值，采用Box－Behnken法設計四因素三水平的二次回歸方程擬合因素和指標(響應值)之間的函數關系，并采用響應面分析法分析各因素之間的交互作用，確定最佳的工藝參數，因素和水平見表1。

表1 響應面模型的因素水平設計表Table 1 Factors and levels for response surface design

2 結果與討論

2.1 單因素條件對蛹蟲草基質多糖得率的影響

2.1.1 料液比的確定 不同料液比對多糖得率的影響結果見圖1。料液比小于1∶30時，多糖得率隨液料比的增大而增加，當料液比大于1∶30后，多糖的提取曲線趨于平緩，甚至略有下降。水量增加利于水溶性的蟲草基質多糖溶出，但加水量過大之后，會增加濃縮過程中工作量和能耗負擔，同時增大了濃縮過程中多糖損耗，從而影響多糖得率，不利于實際操作和生產。

圖1 料液比對蟲草基質多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid－liquid ratio on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.2 酶添加量對多糖提取的影響 不同纖維素酶用量對蛹蟲草基質多糖提取的影響如圖2所示。隨著纖維素酶添加量的增加，多糖的提取量不斷增加;當酶添加量至1500U/g，多糖得率的增加呈現出相對平緩的趨勢。經纖維素酶處理后，多糖的提取量顯著提高。這是因為菌絲體的主要成分是纖維素，纖維素被酶解后，加快了蟲草多糖的溶出，從而提高了多糖提取量［10］。

圖2 纖維素酶添加量對蟲草多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzyme contents on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.3 酶解pH對多糖提取的影響 pH是影響酶活的主要因素。由不同酶解pH下蛹蟲草基質多糖的得率(圖3)可知，當pH為5.5時，多糖的得率最高。pH增大或減小，得率均開始下降。說明在pH5.5時的纖維素酶活較強，pH過高或過低均會對酶的活性產生影響，從而導致得率下降。選取酶解pH在5～6之間比較合適。

圖3 pH對蟲草基質多糖得率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.4 酶解溫度對多糖提取的影響 酶解溫度對蛹蟲草基質多糖提取的影響如圖4所示。溫度會影響纖維素酶的活性，由圖4可知，酶解溫度在35～50℃時，隨著溫度升高，多糖的得率不斷增大，在50℃達到最大值。當酶解溫度大于50℃時，纖維素酶活性受到抑制，多糖得率隨溫度升高反而逐漸下降。因此酶解溫度在50℃為宜。

圖4 酶解溫度對蟲草基質多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.5 酶解時間對多糖提取的影響 由圖5可知，酶解時間低于30min時，隨著處理時間的增加多糖的得率不斷增加，多糖得率提高比較顯著，30～40min之間得率的增加不明顯，40min之后得率有略微下降趨勢。故酶解時間以30～50min為宜。

圖5 酶解時間對蟲草基質多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.6 微波功率對多糖得率的影響 由圖6可知，多糖得率隨著微波功率的增大先增加后減小。當微波輻射時間一定時，微波功率越高，物系吸收微波能越多，菌絲體細胞內部溫度上升越快，對基質中的細胞壁的破壞作用就越大，有利于物料有效成分浸出，從而增加多糖的得率。但如果功率過高，得率會有所下降，因瞬間加熱作用會使被處理成分發(fā)生變性，對提取介質的滲入造成較大的阻礙，同時，局部溫度過高，可能會導致多糖類化合物的分解，從而導致有效成分得率下降，因此適宜的微波功率應該在400～600W之間。

圖6 微波功率對蟲草基質多糖得率的影響Fig.6 Effect of microwave power on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.1.7 微波處理時間對多糖得率的影響 不同微波處理時間對多糖提取率的影響結果見圖7。隨時間增加多糖得率快速升高，微波處理4min時達到最高值，其原因在于微波短時間內即對菌絲體細胞產生很大破壞作用，提高溶出物的量，從而提高多糖得率。之后隨時間增加，多糖得率有下降趨勢，因為微波處理時間過長，不但會由于微波能的過剩，造成物料的焦糊和變性，影響提取的正常進行［14］，而且會促進非多糖類物質的溶出，使產品的純度降低，表現為產品得率下降。故選取3～5min作為微波提取時間考查范圍。

圖7 微波提取時間對蟲草基質多糖得率的影響Fig.7 Effect of microwave extract time on extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

2.2 響應面實驗結果分析

2.2.1 實驗統(tǒng)計模型的建立 響應面分析結果見表2，運用design expert 8.06程序對29個實驗點的響應值Y分別進行回歸分析，并建立相應的響應面回歸模型，得到回歸方程如下:

2.2.2 方差分析 對表2進行方差分析，其結果分別見表3。一般情況下，決定系數(R2)反映方程對數據的擬合程度，在0～1之間取值，Joglekar等指出R2大于0.80表明方程的擬合情況較好［15］?；貧w方程的R2為0.9640，該模型可以解釋96.4%的響應值變化，表明各因子與多糖提取得率之間的線性關系很好;因此方程具有良好的擬合程度，可以對酶－微波法提取蛹蟲草培養(yǎng)基基質多糖進行得率的分析和預測。此外，從表3的方差分析結果可得，所得的蛹蟲草多糖提取得率的回歸方程極顯著(p＜0.0001)，且失擬檢驗不顯著，說明該回歸模型比較理想。從4個因素對多糖得率的影響來看，回歸方程一次項中，X2－酶解時間、X3－微波功率、X4－微波時間均對多糖得率有極顯著的影響，且影響順序為X3＞X2＞X4。二次項中影響顯著;交互項中，X1X2、X1X4、X2X3、X3X4對多糖提取得率的影響顯著，X1X3、X2X4不顯著。

表2 Box－Benhnken響應面實驗結果Table 2 Results of Box－Banhken experiment

2.2.3 模型的驗證 為了解回歸模型的預測能力，對其進行數學分析，可以得到蛹蟲草基質多糖得率的最佳平衡響應值對應的因素條件為加酶量1630U/g、酶解時間 43.82min、微波功率 480.82W，微波時間3.34min，在此條件下得出的多糖得率預測值為18.17%。考慮到實際操作的可行性，將參數修正為加酶量1650U/g、酶解時間44min、微波功率480W、微波時間3.5min。按照上述修正的優(yōu)化提取條件進行5次平行實驗驗證，得到實際測得的平均得率為18.45%。與理論預測值相比，其相對誤差在0.5%以內，表明該模型具有很好的有效性，可以用來預測實驗結果，具有一定的參考價值。

表3 蛹蟲草多糖得率回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis for regression equation of the extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides

3 結論

通過單因素及響應面實驗研究，獲得了微波酶解協(xié)同法提取蛹蟲草多糖的最佳提取工藝，即料液比為1∶30，纖維素酶用量 1650U/g，在 55℃、pH5.5 條件下，酶解處理44min后進行微波提取，微波功率為微波功率480W、提取時間3.5min，最終多糖得率為18.45%，微波協(xié)同纖維素酶法從蛹蟲草培養(yǎng)基質中提取蟲草多糖可以提高效率，節(jié)約成本，提高多糖得率。

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