趨化因子CXCL14在結(jié)直腸癌組織中的表達及其臨床相關(guān)性研究*

林刻智，林峰，鄭雙，沈潔△，沈賢，薛向陽

(1溫州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學實驗中心，浙江溫州 325035;2臺州市第一人民醫(yī)院普外科，浙江臺州 318020;3溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，浙江溫州 325000;4溫州醫(yī)科大學微生物與免疫學教研室，分子病毒與免疫研究所，浙江溫州 325035)

趨化因子CXCL14在結(jié)直腸癌組織中的表達及其臨床相關(guān)性研究*

林刻智1，林峰2，鄭雙2，沈潔2△，沈賢3，薛向陽4△

(1溫州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學實驗中心，浙江溫州 325035;2臺州市第一人民醫(yī)院普外科，浙江臺州 318020;3溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，浙江溫州 325000;4溫州醫(yī)科大學微生物與免疫學教研室，分子病毒與免疫研究所，浙江溫州 325035)

目的:分析趨化因子CXCL14在結(jié)直腸癌組織中的表達，并探討其表達的臨床意義。方法：采用實時熒光定量PCR和免疫組化對40例結(jié)直腸癌及癌旁正常組織CXCL14的表達進行檢測。Kaplan-Meier生存曲線和Cox回歸模型評估CXCL14在結(jié)直腸癌組織中表達的臨床意義。結(jié)果:CXCL14 mRNA和蛋白水平在結(jié)直腸癌組織中的表達較正常組織明顯降低(P＜0.05)。臨床相關(guān)性分析表明，CXCL14表達的下調(diào)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、發(fā)生部位以及臨床病理分期有關(guān)(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，不同CXCL14蛋白表達水平的患者，生存時間具有顯著差異(P＜0.01)。結(jié)論:CXCL14可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

趨化因子CXCL14;生存分析;結(jié)直腸腫瘤

結(jié)直腸癌是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，每年全球約有40萬病例死于該?。?］。迄今，結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的機制仍不清楚。腫瘤微環(huán)境已逐漸被認為是癌癥發(fā)生和發(fā)展的一個重要的參與者［2-4］，其中的趨化因子在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用［3-4］。趨化因子CXCL14是CXC趨化因子家族的一員。研究發(fā)現(xiàn)，CXCL14在不同類型腫瘤表達不一致，在腎癌、肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、宮頸癌等組織中幾乎沒有表達或者表達很低［5-8］，而在部分前列腺癌和胰腺癌中［9-10］卻高水平表達。我們前期胃癌標本檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn)CXCL14表達在腫瘤組織明顯降低［11］。迄今，CXCL14在結(jié)直腸癌中的表達及臨床意義目前仍不清楚。因此，本研究分析CXCL14在結(jié)直腸癌組織中蛋白和mRNA的表達及臨床意義。

材料和方法

1 材料

2 方法

2.1 組織標本采集及處理本研究的結(jié)直腸癌40例患者來自2008年12月至2009年4月臺州市第一人民醫(yī)院內(nèi)鏡活檢確診并經(jīng)外科治療的病人。結(jié)直腸癌的組織病理學診斷由醫(yī)院病理科根據(jù)世界衛(wèi)生組織的標準，術(shù)后證實。所有這些患者術(shù)前未接受放療或化療，術(shù)后根據(jù)美國國立癌癥綜合網(wǎng)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)結(jié)直腸癌指南接受嚴格的化療。以上結(jié)直腸癌組織及相應正常組織(取自距腫瘤邊緣2 cm處)的成對標本(經(jīng)病理確診)均被分為2部分:一部分樣本在手術(shù)切除后30 min，采用液氮冷凍保存，以備RNA的提取;其余組織由4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，進行免疫組化檢測。

2.2 RNA的分離純化總RNA的提取參照Trizol試劑說明書進行。為去除可能污染的DNA，抽提的RNA經(jīng)DNaseⅠ處理后，酚-氯仿抽提，純化的RNA 以DEPC水溶解，用紫外分光光度計檢測RNA濃度后，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 CXCL14 mRNA檢測參照ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μL提取的RNA以O(shè)ligo dT進行逆轉(zhuǎn)錄。反應條件為:42℃60 min，75℃15 min，反應結(jié)束后-20℃保存。以15 μL反應體系進行real-time PCR。相關(guān)分析的引物序列見表1。反應體系包括:1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，1×SYBR Green I Master Mix，0.5 μmol/L特異前向引物，0.5 μmol/L特異反向引物。反應條件為:95℃2 min后，95℃15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。使用Bio-Rad CFX96儀器進行。所有樣品做3復孔。根據(jù)待測標本的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示標本中CXCL14相對表達量，其中ΔΔCt=(CtCXCL14-CtGAPDH)腫瘤-(CtCXCL14-CtGAPDH)正常。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

2.4 免疫組化檢測甲醛固定和石蠟包埋結(jié)直腸癌組織塊樣本切片，厚4 μm，玻片經(jīng)0.1%多聚賴氨酸處理;二甲苯脫蠟至蒸餾水。用0.3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，PBS洗滌3次;檸檬酸鹽緩沖液進行高壓修復1.5 min。自然冷卻至室溫后，PBS(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)洗滌3 次;羊血清封閉2 h;加入Ⅰ抗，4℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔Ⅱ抗37℃，孵育30 min; DAB顯色。蘇木素復染、分化、透明，中性樹膠封片。設(shè)陰性對照組以0.01 mol/L PBS代替Ⅰ抗。結(jié)果判定:CXCL14定位于胞漿，胞漿顯色呈棕色為陽性表達;用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件計算平均吸光度值，并進行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學處理

用統(tǒng)計軟件SPSS 19分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。配對樣本間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗，兩組獨立樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗，3組及以上獨立樣本間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗;采用Kaplan-Meier生存曲線分析CXCL14蛋白表達與預后的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 結(jié)直腸癌組織CXCL14 mRNA的表達

如圖1A所示，CXCL14和GAPDH的熔解曲線為單峰，表明我們建立的實時熒光定量PCR方法能特異擴增目的基因。采用上述實時熒光定量PCR方法，我們進一步分析結(jié)直腸癌組織CXCL14 mRNA的表達。如圖1B所示，腫瘤樣本CXCL14 mRNA的相對表達值明顯低于配對的正常組織(P＜0.01)。

為了能夠有效地測量企業(yè)員工的組織承諾，提高員工對組織的忠誠感與歸屬感，各國學者編制了各種不同的組織承諾量表，比較典型的有以下幾種：

Figure 1.Expression of CXCL14 mRNA in colorectal cancer tissues.A:melting curves;B:relative mRNA expression of CXCL14.Mean±SD.n=20.＊＊P＜0.01 vs normal.圖1 結(jié)直腸癌組織CXCL14 mRNA的表達

2結(jié)直腸癌組織CXCL14蛋白表達的免疫組化分析

結(jié)直腸癌組織與其配對正常組織CXCL14蛋白水平的表達見圖2。CXCL14蛋白表達在胞漿，正常組織CXCL14表達呈強陽性、棕色染色，而腫瘤組織表達低或幾乎無表達。采用半定量分析免疫組化結(jié)果，腫瘤樣本及正常CXCL14的平均吸光度值分別為0.5411和0.1769。統(tǒng)計分析顯示，CXCL14在腫瘤樣品的表達水平低于正常組織(P＜0.01)。

3 CXCL14蛋白表達水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征相關(guān)性

進一步分析腫瘤組織CXCL14的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征相關(guān)性顯示，CXCL14蛋白的表達與腫瘤的發(fā)生部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床病理分期有顯著相關(guān)性(P＜0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌腫瘤組織CXCL14的相對表達量明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織(P＜0.05)。病理分期屬III、IV期的結(jié)直腸癌腫瘤組織CXCL14的相對表達量也明顯低于病理分期屬I、II期的標本(P＜0.05)。CXCL14的表達與年齡、性別、浸潤程度、腫瘤標志物等未見顯著相關(guān)性(P＞0.05)，見表2。

4 腫瘤組織CXCL14表達水平與結(jié)直腸癌預后分析

Figure 2.Expression of CXCL14 protein in colorectal cancer tissues(immunohistochemical staining，×200).A:normal;B1～4:tumorⅠ～Ⅳ，respectively.Mean± SD.n=20.＊＊P＜0.01 vs normal.圖2 結(jié)直腸癌組織CXCL14蛋白的表達

表2 結(jié)直腸癌標本CXCL14蛋白表達與臨床病理特征的相關(guān)性分析Table 2.Correlation between clinicopathological features and CXCL14 protein expression in 40 specimens

40例結(jié)直腸癌標本總生存率為50.0%，根據(jù)成對腫瘤與正常組織CXCL14蛋白表達平均吸光度的相對值，設(shè)≥1/3的為1組，＜1/3為2組，分別為22 和18例。Kaplan-Meier生存分析顯示，1組和2組5年生存率分別為72.7%和11.1%，差異顯著(P＜0.01)，見圖3。

Figure 3.Survival curves of the colorectal cancer patients with different expression levels of CXCL14.1:high expression group:average absorbance value(tumor vs normal)≥1/3;2:low expression group:average absorbance value(tumor vs normal)＜1/3.圖3 直結(jié)腸癌患者不同CXCL14相對表達水平的生存曲線

討論

腫瘤微環(huán)境的研究是目前腫瘤相關(guān)研究的熱點。腫瘤微環(huán)境的細胞能分泌一些趨化因子，調(diào)節(jié)血管生成、宿主特異性免疫激活以及腫瘤細胞生長等腫瘤細胞和間質(zhì)細胞間基本的生物學過程［2-4］。CXCL14是一種新型的趨化因子成員，最初是由Hromas等［12］報道。它的基因位于染色體5p31.1，由77個氨基酸組成［5］。除淋巴組織外，CXCL14在大腦、小腸、腎和上皮細胞等都有表達［6］。炎癥反應時，CXCL14往往傾向于降低［13］。已經(jīng)證實，CXCL14可以抗血管生成，還有趨化自然殺傷細胞、B細胞、巨噬細胞、單核細胞、未成熟樹突狀細胞等多種功能［2，6，13-15］。除了免疫學方面的功能，作為一個多功能趨化因子的CXCL14還與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究顯示，CXCL14在乳腺癌、腎細胞癌、肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、宮頸癌及胃癌組織中的表達減少或缺失［6-8，11-12，16］。Gu等［17］還發(fā)現(xiàn)在乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移中，CXCL14蛋白的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有負相關(guān)性。

為分析CXCL14表達與結(jié)直腸癌的相關(guān)性，本研究通過實時熒光定量PCR和免疫組化檢測結(jié)直腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織CXCL14 mRNA及蛋白表達水平。與絕大多數(shù)腫瘤相關(guān)研究報道一致［6-8，11-12，16］，我們發(fā)現(xiàn)CXCL14在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯低于正常組織。但本研究結(jié)果與最近Zeng等［18］的結(jié)果相反。為排除實驗的誤差，我們嚴格按照該文獻提供的試劑和方法平行進行免疫組化檢測，結(jié)果仍是結(jié)直腸癌組織標本CXCL14表達降低。

進一步分析CXCL14蛋白表達與臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌腫瘤組織CXCL14表達明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織;病理分期屬III、IV期的結(jié)直腸癌腫瘤組織CXCL14的相對表達量也明顯低于病理分期屬I、II期的標本。此外，腫瘤組織CXCL14表達水平與結(jié)直腸癌預后明顯相關(guān)。這些現(xiàn)象提示，CXCL14參與結(jié)直腸癌的發(fā)展。已經(jīng)證實，CXCL14可以通過抑制血管平滑肌細胞的趨化和微血管系統(tǒng)抑制腫瘤血管的形成［2，5，19-20］。這提示CXCL14不但是結(jié)直腸癌預后判斷的重要指標，而且是一個新的候選治療靶點。CXCL14表達水平與腫瘤浸潤深度、性別、年齡、大小、分化等未見明顯相關(guān)性，但直腸癌腫瘤組織CXCL14表達明顯低于結(jié)腸癌組織，可能是不同組織CXCL14的基礎(chǔ)表達水平不同。

綜上所述，結(jié)直腸腫瘤組織中CXCL14表達減少可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展進程。檢測腫瘤組織CXCL14的表達水平可作為結(jié)直腸癌患者預后評價的的臨床輔助指標。

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Down-regulation of chemokine CXCL14 and its clinical relevance in colorectal cancer

LIN Ke-zhi1，LIN Feng2，ZHENG Shuang2，SHEN Jie2，SHEN Xian3，XUE Xiang-yang4
(1Medical Experimental Teaching Center，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China;2Department of General Surgery，Taizhou First People’s Hospital，Taizhou 318020，China;3Department of Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;4Department of Microbiology and Immunology，Institute of Molecular Virology and Immunology，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.E-mail:linfeng0316 @aliyun.com;wzxxy001@163.com)

AIM:To investigate the expression of chemokine CXCL14 and its clinical significance in colorectal cancer.METHODS:The CXCL14 expression was detected by real-time PCR and immunohistochemistry.Kaplan-Meier curve and Cox regression were used to evaluate the clinical significance of CXCL14 in colorectal cancer.RESULTS:The expression of CXCL14 at mRNA and protein levels declined in colorectal cancer tissues compared with the paired normal tissues(P＜0.05).Down-regulation of CXCL14 was associated with tumor lymph node metastasis，the site and the clinical pathological stage(P＜0.05)，and also correlated with the prognosis closely.Kaplan-Meier survival analysis showed that the protein expression levels of CXCL14 were significantly different in the patients with different survival time(P＜0.01).CONCLUSION:It is possible that CXCL14 acts a role in the development and progression of colorectal cancer.

Chemokine CXCL14;Survival analysis;Colorectal neoplasms

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.030

1000-4718(2014)02-0355-05

2013-09-22

2013-12-27

浙江省科技廳公益性技術(shù)應用研究計劃項目(No.2012C37080);浙江省教育廳項目(No.Y201327980)

△通訊作者Tel:0577-86689910;沈潔E-mail:linfeng0316@aliyun.com;薛向陽E-mail:wzxxy001@163.com