丁苯酞可減輕缺氧缺糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體損傷*

解龍昌，張波，高慶春，傅賢，李又福，劉紅英，魏歡

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州 510260;2昆明市延安醫(yī)院，云南昆明 650051)

丁苯酞可減輕缺氧缺糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體損傷*

解龍昌1△，張波1，高慶春1，傅賢1，李又福1，劉紅英1，魏歡2

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州 510260;2昆明市延安醫(yī)院，云南昆明 650051)

目的:探討丁苯酞(DL-3-n-butylphthalide，NBP)對缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)條件下內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。方法：對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)予以O(shè)GD損傷，使用MitoTracker Green對線粒體進(jìn)行定位并觀察線粒體形態(tài)的變化。使用MitoSOX Red標(biāo)記線粒體內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，免疫熒光法觀察NBP對OGD條件下細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響。使用SOD活性試劑盒檢測NBP對OGD條件下HUVECs內(nèi)SOD活性的影響。結(jié)果:NBP明顯減少了OGD誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體的斷裂，抑制了線粒體內(nèi)ROS的生成，提高了OGD誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)SOD的活性。結(jié)論:NBP可能是通過保護(hù)OGD條件下內(nèi)皮細(xì)胞線粒體的功能和增加細(xì)胞內(nèi)ROS清除，減少線粒體內(nèi)ROS生成，最終減輕了線粒體損傷。

丁苯酞;血管內(nèi)皮細(xì)胞;缺氧缺糖;線粒體;活性氧簇

左旋丁基苯酞又名芹菜甲素，是從芹菜種籽中分離出的有效成分，根據(jù)它的結(jié)構(gòu)式，其異構(gòu)體右旋丁基苯酞被合成出來。之后它們的混合物消旋丁基苯酞(DL-3-n-butylphthalide，NBP)作為臨床藥物被廣泛應(yīng)用，也稱為丁苯酞［1］。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)NBP可以增加內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)條件下缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)的表達(dá)和在細(xì)胞核內(nèi)的聚集，從而促進(jìn)下游血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)增多，最終保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受OGD損傷［2］。NBP對OGD條件下的內(nèi)皮細(xì)胞是否還存在其它保護(hù)機(jī)制，我們?nèi)圆簧跚宄?。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量生成和儲存的主要場所，缺血缺氧后線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性急劇降低，呼吸鏈電子傳遞受抑制，可產(chǎn)生大量的氧自由基［3］，而繼發(fā)性氧自由基增加是造成血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元損傷的重要因素。既往研究發(fā)現(xiàn)NBP可以抑制黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中超氧陰離子自由基的形成，還可升高腦皮質(zhì)總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性和升高谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性，從而發(fā)揮抗自由基的作用［4］，但目前仍無相關(guān)研究直接觀察NBP對OGD條件下線粒體中自由基和線粒體形態(tài)的影響。

既往的研究證實(shí)NBP有改善線粒體功能失調(diào)等作用［5］。我們猜測NBP可能會通過影響OGD條件下內(nèi)皮細(xì)胞線粒體活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的生成，從而保護(hù)線粒體，最終達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。我們希望通過本實(shí)驗(yàn)具體研究NBP對內(nèi)皮細(xì)胞線粒體所產(chǎn)生的保護(hù)作用，從而深入探索NBP保護(hù)缺血性腦卒中狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制。在未來的研究中以此為基礎(chǔ)，對NBP進(jìn)行改進(jìn)和發(fā)展，使此藥能夠更加有效和確切地發(fā)揮治療腦卒中的作用。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)(購自上海晶賽公司)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、90%濕度、含5%CO2和95%空氣(V/ V)的培養(yǎng)箱中。

NBP(石家莊恩必普藥業(yè)有限公司贈送，99.9%)臨用前使用DMSO溶解，再使用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。NBP的最終濃度采用具有最佳保護(hù)作用的10 μmol/L［2］。在溶劑對照組中只單獨(dú)加入DMSO。

2 OGD細(xì)胞模型

OGD模型按照既往發(fā)表的方法進(jìn)行。將內(nèi)皮細(xì)胞種植于各種規(guī)格的培養(yǎng)皿，共24 h。在NBP處理組將培養(yǎng)液換成含有不同濃度NBP的無糖DMEM培養(yǎng)液(其中含0.2%DMSO的溶媒)，在溶劑處理組換為僅含有0.2%DMSO的無糖DMEM培養(yǎng)液，各培養(yǎng)30 min。之后細(xì)胞被放置于持續(xù)充以95%N2+ 5%CO2混合氣體的密封低氧槽中，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)所需，在37℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育所需時間。當(dāng)OGD結(jié)束，在移入正常氧壓條件前，將培養(yǎng)液換成含有相同濃度的NBP或者單純DMSO溶劑的正常培養(yǎng)基。在正常對照組，細(xì)胞接受除了無糖培養(yǎng)基或者缺氧處理之外的所有實(shí)驗(yàn)操作步驟。

3 檢測線粒體內(nèi)ROS

MitoSOX Red是一種對活細(xì)胞線粒體中ROS具有高度選擇性的熒光染料，可快速和選擇性地被線粒體中的ROS氧化，從而顯示出紅色熒光，熒光亮度的強(qiáng)弱可代表線粒體內(nèi)ROS量的多少。MitoTracker Green是一種線粒體綠色熒光染料，其定位于線粒體的能力不受線粒體膜電位影響，可以用來對固定細(xì)胞的線粒體進(jìn)行染色，熒光的位置和形態(tài)代表了線粒體所在的位置和形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，為進(jìn)一步確定MitoSOX Red所染色的是線粒體內(nèi)的ROS，我們使用MitoTracker Green染色線粒體來進(jìn)行復(fù)染定位，如果MitoSOX Red與Mitoraker Green的熒光可以高度重合，就進(jìn)一步說明我們發(fā)現(xiàn)的ROS是存在于線粒體中的。

將已用DMSO溶解的不同濃度的MitoTracker Green和MitoSOX Red各取1 μL，共同溶解到1 mL Hank＇s液，得到終濃度為1 mmol/L MitoTracker Green溶液和5 mmol/L MitoSOX Red溶液。內(nèi)皮細(xì)胞種植于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，完成預(yù)處理后，缺氧1 h，用PBS洗滌各孔。加入上述的MitoTracker Green和MitoSOX Red溶液，置于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃條件下溫育20 min后，小心吸棄MitoTracker Green 和MitoSOX Red溶液，使用Hanks液清洗3次，在熒光顯微鏡下拍攝熒光照片(在5 min內(nèi)拍攝完畢，選擇手動曝光，保持各組相同的曝光時間)，采用美國Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，測定熒光圖片的平均吸光度值。

4 線粒體形態(tài)分析

為觀察線粒體形態(tài)的變化，按照方法3中所述的方法，對處理后的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行MitoTracker Green染色，然后在熒光顯微鏡下拍攝熒光照片(在5 min內(nèi)拍攝完畢，選擇手動曝光，保持各組相同的曝光時間，放大倍數(shù)×40)。根據(jù)既往報道的研究方法［6］，如細(xì)胞中顯示為融合的長條狀線粒體則被標(biāo)記為“fusion”，如細(xì)胞中顯示為分散的小而圓形的線粒體占總線粒體的90%以上則被標(biāo)記為“fission”。為定量分析線粒體的形態(tài)，每組隨機(jī)抽取10幅顯微鏡拍攝的熒光照片，人工計(jì)數(shù)標(biāo)記為“fission”的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算其所占的比例。所有結(jié)果來自5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)中設(shè)3個平行組。

5 SOD活性檢測

超氧陰離子自由基可以氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色。當(dāng)被測定樣品中含有SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，通過比色法可以測定被測樣品具有的SOD活性［7］。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。獨(dú)立樣本之間的差異顯著性通過ANOVA方法進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 NBP抑制了OGD誘發(fā)的線粒體斷裂

在正常的細(xì)胞中，線粒體表現(xiàn)為典型的融合長條狀(fusion);經(jīng)過OGD處理后線粒體的形態(tài)則轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚⒌男×?fission);使用NBP預(yù)處理后再進(jìn)行OGD，可使含有分散小粒狀線粒體的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。這說明NBP可抑制OGD誘發(fā)的線粒體斷裂。

Figure 1.NBP significantly reduced OGD-induced mitochondrial fragmentation(fission).Mean±SD.n=15.*P＜0.05 vs normal control;#P＜0.05 vs OGD.圖1 NBP顯著抑制OGD導(dǎo)致的HUVECs內(nèi)線粒體形態(tài)改變

2 NBP減輕OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞SOD活性下降

正常對照組、OGD組和OGD+NBP組中SOD的活性分別為38.64×103U/L、18.98×103U/L和36.82×103U/L。OGD顯著降低了內(nèi)皮細(xì)胞中SOD的活性。而使用NBP預(yù)處理后再進(jìn)行OGD，可明顯減輕OGD誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性下降(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.NBP significantly inhibited OGD-induced decrease in SOD activity.Mean±SD.n=15.*P＜0.05 vs normal control;#P＜0.05 vs OGD.圖2 NBP顯著抑制OGD導(dǎo)致的HUVECs SOD活性的下降

3 NBP對OGD誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體ROS生成量的影響

正常培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)只有微量的ROS生成，從照片上看熒光強(qiáng)度比較弱。OGD后內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的量明顯增高，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。使用NBP預(yù)處理后再進(jìn)行缺氧，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的量明顯降低，幾乎同正常內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS量相當(dāng)。使用圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，可確定NBP降低OGD后線粒體內(nèi)ROS的量(P＜0.05)，見圖3。

討論

氧分子擁有2個不成對電子，屬于自由基，但受其特殊結(jié)構(gòu)的限制，不表現(xiàn)出強(qiáng)的自由基活性。1個氧分子接受4個電子被還原成2分子水。如果氧分子沒有被完全還原，就可以變成各種自由基，如接受1個電子產(chǎn)生超氧陰離子()，再接受1個電子產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)，再接受1個電子產(chǎn)生羥自由基(OH·)［8］。由于功能上的相似性，這些物質(zhì)被統(tǒng)稱為ROS，它具有很強(qiáng)的毒性，可導(dǎo)致組織和細(xì)胞的損傷［9］，ROS的大量增多可造成蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)損傷，還可導(dǎo)致不可控制的增殖和凋亡［10］。

缺血再灌注損傷時，可通過多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基生成增多，其中線粒體功能障礙是導(dǎo)致自由基生成增多的重要原因之一。因缺血、缺氧使ATP減少，鈣進(jìn)入線粒體增多，使線粒體功能受損，細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，進(jìn)入細(xì)胞的氧經(jīng)4個電子還原成水減少，而經(jīng)單電子還原生成氧自由基增多。而鈣離子進(jìn)入線粒體可使錳-超氧化物歧化酶減少，對自由基的清除能力降低，使氧自由基生成進(jìn)一步增加。自由基可減少ATP生成，導(dǎo)致線粒體的功能抑制，使細(xì)胞的能量代謝障礙加重，從而導(dǎo)致惡性循環(huán)。

Figure 3.NBP significantly attenuated OGD-induced ROS production in mitochondria.Mean±SD.n=15.*P＜0.05 vs normal control;#P＜0.05 vs OGD.圖3 NBP顯著減少了OGD誘發(fā)的線粒體內(nèi)ROS生成

在本實(shí)驗(yàn)中我們確實(shí)觀察到NBP對OGD損傷后線粒體中ROS的含量產(chǎn)生明顯影響。正常內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)只有微量的ROS生成，OGD損傷后內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的含量明顯增高。使用NBP預(yù)處理后再進(jìn)行OGD損傷，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的含量明顯降低，幾乎同正常內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS量相當(dāng)。為了保證我們觀察到得ROS是產(chǎn)生于線粒體內(nèi)，我們使用了MitoSOX Red與MitoTracker Green 2種染料來進(jìn)行復(fù)染，2種顏色的熒光高度重合，進(jìn)一步說明我們發(fā)現(xiàn)的ROS是存在于線粒體中的。

NBP通過何種機(jī)制達(dá)到減少OGD條件下線粒體內(nèi)ROS?我們進(jìn)行了深入的研究。首先我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NBP可以對OGD后線粒體的形態(tài)產(chǎn)生顯著的影響。既往的研究證實(shí)，線粒體的功能可反映在其結(jié)構(gòu)和形態(tài)上。正常情況下，線粒體呈現(xiàn)出相互連結(jié)的管狀網(wǎng)絡(luò)樣形態(tài)，以fusion形態(tài)為主，只有少量分裂的顆粒狀的fission形態(tài)，2種形態(tài)保持著平衡［11］。而卒中導(dǎo)致的缺血缺氧可引起相互融合的線粒體持續(xù)性分裂，此時以fission形態(tài)為主［12］。這與本實(shí)驗(yàn)中觀察到的線粒體形態(tài)變化是一致的，OGD導(dǎo)致了線粒體中fission形態(tài)明顯增多，而NBP預(yù)處理可明顯減少這一變化。這說明NBP維持了線粒體結(jié)構(gòu)的完整性和減輕了線粒體功能的喪失，NBP對OGD損傷的線粒體產(chǎn)生了很好的保護(hù)作用。線粒體功能受到保護(hù)，線粒體呼吸鏈上的電子得到順利傳遞，必然導(dǎo)致線粒體內(nèi)ROS生成減少。除此以外，我們還觀察到NBP可明顯改善OGD誘導(dǎo)的SOD活性下降，SOD活性得到保護(hù)，可增加ROS的清除。既往研究也表明NBP可顯著提高缺氧損傷中降低了的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ和Ⅳ的活性［13］，電子可以順利通過呼吸鏈傳遞，這可導(dǎo)致ROS生成減少。NBP還可以提高線粒體中SOD和GSH-Px的活性［4］，這可增加對ROS的清除。這些研究與本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果是一致的。

綜上所述，我們認(rèn)為NBP對OGD條件下內(nèi)皮細(xì)胞線粒體具有明顯的保護(hù)作用，從而減少了線粒體ROS的生成，進(jìn)而ROS對線粒體的損傷作用也得到緩解。

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DL-3-n-butylphthalide attenuates mitochondrial damage in vascular endothelial cells under the condition of oxygen-glucose deprivation

XIE Long-chang1，ZHANG Bo1，GAO Qing-chun1，F(xiàn)U Xian1，LI You-fu1，LIU Hongying1，WEI Huan2
(1Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China;2Yan’an Hospital of Kunming City，Kunming 650051，China.E-mail:longchang3907@163.com)

AIM:To investigate the mechanism in which DL-3-n-butylphthalide(NBP)protects the mitochondria from the damage of oxygen-glucose deprivation(OGD).METHODS:Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)were exposed to OGD to induce endothelial damage.Mitochondrial morphology and mitochondrial reactive oxygen species(ROS)were examined using MitoTracker Green and MitoSOX Red，respectively.The activity of superoxide dismutase(SOD)was evaluated by SOD assay kit.RESULTS:NBP significantly attenuated OGD-induced mitochondrial fragmentation，reduced the content of mitochondrial ROS and increased the activity of SOD.CONCLUSION:NBP alleviates OGD-induced damage in the mitochondria.Reduction of mitochondrial ROS and enhancement of SOD activity may be the mechanism in which NBP protects mitochondria.

Butylphthalide;Vascular endothelial cells;Oxygen-glucose deprivation;Mitochondria;Reactive oxygen species

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.026

1000-4718(2014)02-0339-05

2013-08-12

2013-12-02

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2012010008808)

△通訊作者Tel:020-34153252;E-mail:longchang3907@163.com