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      5型腺病毒載體對(duì)人T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞毒性分析*

      2014-05-16 01:14:38張文峰張瓊宇邵紅偉吳鳳麟王騰黃樹(shù)林
      中國(guó)病理生理雜志 2014年2期
      關(guān)鍵詞:原代腺病毒細(xì)胞周期

      張文峰,張瓊宇,邵紅偉,吳鳳麟,王騰,黃樹(shù)林△

      (1廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,2廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510006;3永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,湖南永州 425100)

      ·短篇論著·

      5型腺病毒載體對(duì)人T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞毒性分析*

      張文峰1,2,張瓊宇3,邵紅偉1,2,吳鳳麟1,2,王騰1,2,黃樹(shù)林1,2△

      (1廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,2廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510006;3永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,湖南永州 425100)

      目的:利用5型腺病毒載體轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞,對(duì)其轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞的效率以及細(xì)胞毒性進(jìn)行分析。方法:選取T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞及原代T細(xì)胞,腺病毒按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為20、50、100、200和400對(duì)其轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48 h后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;選取腺病毒轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)點(diǎn),利用碘化丙啶染色法分析轉(zhuǎn)染對(duì)于細(xì)胞周期的影響;利用Annexin V/7-AAD染色法分析轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況;利用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法分析轉(zhuǎn)染對(duì)活細(xì)胞數(shù)目的影響。結(jié)果:5型腺病毒載體轉(zhuǎn)染T淋巴瘤的效率最高,轉(zhuǎn)染效率隨著MOI值的增大而增加;CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率大致相同,T細(xì)胞經(jīng)刺激活化后,CD8+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率下降;病毒轉(zhuǎn)染未導(dǎo)致明顯細(xì)胞凋亡;病毒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞周期與活細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著影響。結(jié)論:5型腺病毒載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞呈現(xiàn)較低細(xì)胞毒性。

      腺病毒載體;T淋巴細(xì)胞;細(xì)胞毒性

      T細(xì)胞通過(guò)膜表面的T細(xì)胞受體(T-cell receptor,TCR)發(fā)揮抗原識(shí)別作用[1-2]。利用抗原特異性TCR基因修飾T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼性移植/回輸,在抑制腫瘤生長(zhǎng)、控制病毒感染等方面具有良好的前景[3-4]。腺病毒載體因具有能感染增殖和非增殖細(xì)胞、無(wú)插入致突變性、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因等優(yōu)點(diǎn),是基因治療中的理想載體工具,有望在TCR基因修飾T細(xì)胞治療中發(fā)揮重要作用。

      目前主要使用的腺病毒載體為血清型5型腺病毒(adenovirus serotype 5,Ad5)載體,本實(shí)驗(yàn)利用Ad5轉(zhuǎn)染人T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞及原代T細(xì)胞,確定其轉(zhuǎn)染效率;并在轉(zhuǎn)染后的各個(gè)不同時(shí)點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和活細(xì)胞數(shù)目檢測(cè),評(píng)價(jià)Ad5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞毒性,為進(jìn)一步研究腺病毒載體在TCR基因修飾T細(xì)胞的過(guò)繼性治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

      材料和方法

      1 材料

      Jurkat細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存,腺病毒穿梭載體pDC315與骨架載體pBHGloxΔE1,3Cre購(gòu)自Microbix。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自灝洋生物制劑技術(shù)公司,AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基和無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco,胰蛋白酶購(gòu)自Amresco,胎牛血清購(gòu)自Gibco,propidium iodide購(gòu)自TaKaRa,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體CD8-PE、CD4-PE-Cy5和Annexin V/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Ebioscience,Trypan blue購(gòu)自廣州威佳生物公司,CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo,Coulter Elite流式細(xì)胞儀購(gòu)自貝克曼公司。

      2 方法

      2.1 淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取健康人外周血,F(xiàn)icoll-Hapaque密度梯度離心法分離健康供血者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),用RPMI-1640將細(xì)胞調(diào)至2×109/L。移至培養(yǎng)瓶中豎立培養(yǎng)(20 mL/瓶),再加入10%胎牛血清和2×104IU/L白細(xì)胞介素2(interleukin 2,IL-2),37℃培養(yǎng)。

      2.2 病毒轉(zhuǎn)染分離的PBMC以1×109cells/L在AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h,細(xì)胞刺激活化組則在培養(yǎng)基中補(bǔ)加有終濃度6×105IU/L IL-2和10 μg/L anti-CD3抗體;1 000×g離心5 min,棄上清,AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞為1×109cells/L,接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,按不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)加入腺病毒并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;1 000×g離心5 min,棄上清,加入新鮮AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至不同時(shí)點(diǎn)。

      2.3 細(xì)胞周期的測(cè)定取腺病毒轉(zhuǎn)染后不同時(shí)點(diǎn)的T細(xì)胞,800×g離心10 min棄上清;PBS洗1次,800×g離心10 min棄上清;加0.5 mL PBS吹勻;用5 mL注射器將細(xì)胞吸起,用力打入5 mL 70%預(yù)冷乙醇中,4℃固定過(guò)夜;800×g離心15 min收集固定細(xì)胞,PBS洗2次;用0.4 mL PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至tube中輕輕吹打;加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 mg/L,37℃水浴消化30 min;加PI約50 μL至終濃度約為65 mg/L,在冰浴中避光染色30 min;經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

      2.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)取腺病毒轉(zhuǎn)染后不同時(shí)點(diǎn)的Jurkat細(xì)胞,800×g離心10 min,棄上清;PBS洗1次,800×g離心10 min,棄上清;加2 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,800×g離心10 min,棄上清;加100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,隨后加入5 μL Annexin V-PE,室溫避光孵育15 min;加入2 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,800×g離心10 min,棄上清;加500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,隨后加入5 μL 7-AAD,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

      2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Jurkat細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔5×105細(xì)胞,按所選MOI值加入腺病毒,未經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組;放置37℃培養(yǎng)48 h和72 h后,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目,取4個(gè)孔的均值。

      3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用方差分析(ANOVA)對(duì)組間差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié)果

      1 Ad5針對(duì)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

      Ad5-GFP轉(zhuǎn)染各種T細(xì)胞48 h后的效率見(jiàn)圖1。在MOI值相同時(shí),Ad5-GFP對(duì)T淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高,并且隨著MOI值的升高,轉(zhuǎn)染效率隨之增加;當(dāng)MOI為400時(shí),大約60%的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)。Ad5-GFP對(duì)原代CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力大致相當(dāng),轉(zhuǎn)染效率并未隨MOI值的升高而顯著增加;在MOI為400時(shí),約15%的CD8+T細(xì)胞和約13%的CD4+T細(xì)胞表達(dá)GFP。當(dāng)外周血T細(xì)胞預(yù)先用CD3抗體和IL-2、干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)等細(xì)胞因子刺激活化后,CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞所占比例有所提高,CD8+T為50%,CD4+T為32%(結(jié)果未顯示),在MOI為400時(shí),約9%的CD4+T細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染;經(jīng)刺激活化后,Ad5-GFP針對(duì)CD8+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯下降,在MOI為400時(shí),僅4%的CD8+T細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。

      Figure 1.The Ad5 transfection efficiencies for T cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs MOI 20 group.圖1 Ad5針對(duì)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率結(jié)果

      2 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況

      磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)位于細(xì)胞膜磷脂雙分子層的內(nèi)側(cè),當(dāng)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時(shí),PS會(huì)發(fā)生外翻到細(xì)胞膜脂雙層外側(cè),外翻的PS會(huì)被Annexin V結(jié)合,而染料7-AAD無(wú)法通過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部,Annexin V+/7-AAD-細(xì)胞即為早期凋亡細(xì)胞;細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡時(shí),染料7-AAD會(huì)穿過(guò)凋亡細(xì)胞膜上小孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,Annexin V+/7-AAD+細(xì)胞即為晚期凋亡細(xì)胞。Ad5-GFP轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn),利用Annexin V-PE/7-AAD檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,如圖2所示,相比未發(fā)生病毒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞,病毒轉(zhuǎn)染后早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞所占的比例均沒(méi)有出現(xiàn)明顯增加。圖2中還列出了病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞結(jié)合染料Annexin V-PE的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescent intensity,MFI),該值反映出每個(gè)細(xì)胞所結(jié)合染料Annexin V的情況,細(xì)胞膜上發(fā)生外翻的PS越多,其MFI值就越大。在病毒轉(zhuǎn)染后的相同時(shí)點(diǎn),隨著病毒MOI值的增加,其MFI值出現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。MFI值的減少也許與腺病毒通過(guò)細(xì)胞胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有關(guān)。

      3 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

      經(jīng)不同MOI值轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞,被植物血凝素刺激不同時(shí)間(48 h和72 h)后活細(xì)胞數(shù)目的變化情況見(jiàn)圖3。隨著刺激時(shí)間增加,所選MOI值轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞數(shù)目均有增加;在同一刺激時(shí)段,與未發(fā)生病毒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比較,各MOI值轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞數(shù)目未發(fā)現(xiàn)明顯下降,表明Jurkat細(xì)胞在被腺病毒轉(zhuǎn)染后,對(duì)外界刺激所具有的增殖能力并未受到影響。

      4 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞周期影響

      在病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后48 h和72 h,相對(duì)于未發(fā)生病毒轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照組細(xì)胞,處于G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例未見(jiàn)明顯變化,沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯于某個(gè)時(shí)期,見(jiàn)表1。

      討論

      Ad5利用病毒纖毛頭節(jié)區(qū)結(jié)合細(xì)胞膜表面的柯薩奇-腺病毒受體(coxsackie-adenovirus receptor,CAR)完成病毒與靶細(xì)胞的吸附,然后通過(guò)病毒纖毛基底部五鄰體與靶細(xì)胞膜表面的整合素相互作用內(nèi)化到細(xì)胞中并進(jìn)入溶酶體,最后腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,通過(guò)核孔將病毒DNA釋放到細(xì)胞核內(nèi)[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ad5-GFP轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞的效率明顯高于原代T淋巴細(xì)胞,也許和Jurkat細(xì)胞表面的CAR與整合素的表達(dá)有關(guān);抗體和細(xì)胞因子刺激活化后的CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出更難以被Ad5-GFP轉(zhuǎn)染,或許是刺激活化導(dǎo)致細(xì)胞CAR與整合素的表達(dá)水平發(fā)生變化,也可能與病毒顆粒在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸效率有關(guān)[6],有關(guān)Ad5在T細(xì)胞中運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制有待進(jìn)一步研究。

      Figure 2.The apoptosis of Jurkat cells after Ad5 transfection detected by flow cytometry and Annexin V/7-AAD staining.Mean±SD.n=3.MFI:mean fluorescent intensity.圖2 Ad5轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

      在本實(shí)驗(yàn)所選擇的MOI值條件下,磷脂酰絲氨酸外翻細(xì)胞的所占比例未顯著提高,未發(fā)現(xiàn)Ad5轉(zhuǎn)染導(dǎo)致T細(xì)胞的顯著凋亡。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)病毒MOI值的增加導(dǎo)致單個(gè)細(xì)胞上磷脂酰絲氨酸外翻數(shù)目減少的現(xiàn)象,可能與腺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞胞吞進(jìn)入細(xì)胞的方式有關(guān)。以往研究結(jié)果表明膽固醇在腺病毒的胞吞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7],磷脂酰絲氨酸是否在腺病毒的胞吞過(guò)程中起到重要作用以及具體參與方式等問(wèn)題,有待進(jìn)一步的研究。

      逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及慢病毒載體是目前基因治療中最常用的2種病毒載體,但由于其滴度偏低、可能在淋巴細(xì)胞基因組內(nèi)隨機(jī)插入產(chǎn)生致瘤的風(fēng)險(xiǎn),因此并不是TCR基因修飾T細(xì)胞過(guò)繼性治療中的理想載體[8]。本研究對(duì)Ad5轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞的效率以及細(xì)胞毒性進(jìn)行了初步的分析,發(fā)現(xiàn)Ad5轉(zhuǎn)染原代T淋巴細(xì)胞的效率偏低,以往研究結(jié)果表明增加病毒轉(zhuǎn)染的MOI值將會(huì)有效提高病毒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的能力[9],因此可以采用提高M(jìn)OI值的方法提高Ad5轉(zhuǎn)染原代T細(xì)胞的效率;在細(xì)胞周期檢測(cè)中,未發(fā)現(xiàn)Ad5轉(zhuǎn)染引起細(xì)胞周期阻滯;在活細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)中,T細(xì)胞對(duì)刺激的活化增殖能力未受到Ad5轉(zhuǎn)染的影響,表明Ad5介導(dǎo)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的低細(xì)胞毒性。綜上所述,Ad5腺病毒載體是TCR基因治療的一種合適載體,在以后的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

      Figure 3.The effects of transfection with Ad5 on the proliferation of Jurkat cells.Mean±SD.n=5.圖3 Ad5轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

      表1 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞周期分析結(jié)果Table 1.The effects of transfection with Ad5 on the cell cycle of T lymphocytes(Mean±SD.n=3)

      [1]Bjorkman PJ,Saper MA,Samraoui B,et al.The foreign antigen binding site and T cell recognition regions of class I histocompatibility antigens[J].Nature,1987,329 (6139):512-518.

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      Transfection efficiency and cytotoxicity in human T lymphocytes infected with Ad5 adenoviral vector

      ZHANG Wen-feng1,2,ZHANG Qiong-yu3,SHAO Hong-wei1,2,WU Feng-lin1,2,WANG Teng1,2,HUANG Shu-lin1,2
      (1School of Life Science&Biopharmacology,2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology Candidate Drug Research,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;3Department of Basic Medical Science,Yongzhou Vocational Technical College,Yongzhou 425100,China.E-mail:shulhuang@sina.com)

      AIM:To determine the transfection efficiencies and to evaluate the cytotoxicity of infection with Ad5 adenoviral vector in human T lymphocytes.METHODS:The T-lymphoma Jurkat cell line,normal CD3+T cells and pre-stimulated CD3+T cells were transfected with Ad5 adenovirus at multiplicities of infection(MOI)ranging from 20 to 400.GFP expression was analyzed by flow cytometry 48 h after transfection.The cells were harvested 24 h,48 h and 72 h after transfection.The cell cycle was analyzed using propidium iodide staining and the apoptosis of T lymphocytes was detected by annexin V/7-AAD staining.Trypan blue exclusion assay was used to determine the survival cell numbers after 48 h or 72 h of transfection.RESULTS:The transfection of primary human T cells by the Ad5 virus was less efficient than that of a T-lymphoma cell line.Similar transfection efficiency was observed in both CD4+T lymphocytes and CD8+T lymphocytes.The activation of T lymphocytes resulted in a decrease in Ad5 transfection efficiency in CD8+T cells.Following transfection(24 h,48 h and 72 h),the percentages of G0/G1-phase cells,S-phase cells,G2/M-phase cells and apoptotic cells at all MOI did not change significantly.Therefore,transfection by the Ad5 adenoviral vector did not influence the cell cycle and survival cell numbers.CONCLUSION:The Ad5 adenoviral vector,which shows little cytotoxicity to T lymphocytes,may be a valuable tool for T cell receptor gene therapy.

      Adenoviral vector;T lymphocytes;Cytotoxicity

      1000-4718(2014)02-0318-05

      R363

      A

      10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.022

      2013-09-05

      2013-12-23

      科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)“十一五”計(jì)劃項(xiàng)目(No.2009ZX09103-708);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31100664;No.31300737;No.81303292);東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011105102027)

      △通訊作者Tel:020-39352201;E-mail:shulhuang@sina.com

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      傳染病信息(2022年3期)2022-07-15 08:22:14
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      新生大鼠右心室心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定
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      艾迪注射液對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP1A2、CYP3A2酶活性的影響
      中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:32
      某部腺病毒感染疫情調(diào)查分析
      豬乙型腦炎PrM-E重組腺病毒的構(gòu)建及免疫原性
      NSCLC survivin表達(dá)特點(diǎn)及其與細(xì)胞周期的關(guān)系研究
      X線照射劑量率對(duì)A549肺癌細(xì)胞周期的影響
      載EPO腺病毒的PLGA納米纖維支架在體內(nèi)促進(jìn)骨缺損修復(fù)作用
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