5型腺病毒載體對(duì)人T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞毒性分析*

張文峰，張瓊宇，邵紅偉，吳鳳麟，王騰，黃樹(shù)林△

(1廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，2廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006;3永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南永州 425100)

·短篇論著·

5型腺病毒載體對(duì)人T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞毒性分析*

張文峰1，2，張瓊宇3，邵紅偉1，2，吳鳳麟1，2，王騰1，2，黃樹(shù)林1，2△

(1廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，2廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006;3永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南永州 425100)

目的:利用5型腺病毒載體轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞，對(duì)其轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞的效率以及細(xì)胞毒性進(jìn)行分析。方法：選取T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞及原代T細(xì)胞，腺病毒按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為20、50、100、200和400對(duì)其轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;選取腺病毒轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)點(diǎn)，利用碘化丙啶染色法分析轉(zhuǎn)染對(duì)于細(xì)胞周期的影響;利用Annexin V/7-AAD染色法分析轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況;利用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法分析轉(zhuǎn)染對(duì)活細(xì)胞數(shù)目的影響。結(jié)果:5型腺病毒載體轉(zhuǎn)染T淋巴瘤的效率最高，轉(zhuǎn)染效率隨著MOI值的增大而增加;CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率大致相同，T細(xì)胞經(jīng)刺激活化后，CD8+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率下降;病毒轉(zhuǎn)染未導(dǎo)致明顯細(xì)胞凋亡;病毒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞周期與活細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著影響。結(jié)論:5型腺病毒載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞呈現(xiàn)較低細(xì)胞毒性。

腺病毒載體;T淋巴細(xì)胞;細(xì)胞毒性

T細(xì)胞通過(guò)膜表面的T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)發(fā)揮抗原識(shí)別作用［1-2］。利用抗原特異性TCR基因修飾T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼性移植/回輸，在抑制腫瘤生長(zhǎng)、控制病毒感染等方面具有良好的前景［3-4］。腺病毒載體因具有能感染增殖和非增殖細(xì)胞、無(wú)插入致突變性、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，是基因治療中的理想載體工具，有望在TCR基因修飾T細(xì)胞治療中發(fā)揮重要作用。

目前主要使用的腺病毒載體為血清型5型腺病毒(adenovirus serotype 5，Ad5)載體，本實(shí)驗(yàn)利用Ad5轉(zhuǎn)染人T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞及原代T細(xì)胞，確定其轉(zhuǎn)染效率;并在轉(zhuǎn)染后的各個(gè)不同時(shí)點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和活細(xì)胞數(shù)目檢測(cè)，評(píng)價(jià)Ad5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞毒性，為進(jìn)一步研究腺病毒載體在TCR基因修飾T細(xì)胞的過(guò)繼性治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

Jurkat細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，腺病毒穿梭載體pDC315與骨架載體pBHGloxΔE1，3Cre購(gòu)自Microbix。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自灝洋生物制劑技術(shù)公司，AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基和無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，胰蛋白酶購(gòu)自Amresco，胎牛血清購(gòu)自Gibco，propidium iodide購(gòu)自TaKaRa，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體CD8-PE、CD4-PE-Cy5和Annexin V/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Ebioscience，Trypan blue購(gòu)自廣州威佳生物公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo，Coulter Elite流式細(xì)胞儀購(gòu)自貝克曼公司。

2 方法

2.1 淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取健康人外周血，F(xiàn)icoll-Hapaque密度梯度離心法分離健康供血者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，用RPMI-1640將細(xì)胞調(diào)至2×109/L。移至培養(yǎng)瓶中豎立培養(yǎng)(20 mL/瓶)，再加入10%胎牛血清和2×104IU/L白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)，37℃培養(yǎng)。

2.2 病毒轉(zhuǎn)染分離的PBMC以1×109cells/L在AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，細(xì)胞刺激活化組則在培養(yǎng)基中補(bǔ)加有終濃度6×105IU/L IL-2和10 μg/L anti-CD3抗體;1 000×g離心5 min，棄上清，AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞為1×109cells/L，接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)加入腺病毒并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;1 000×g離心5 min，棄上清，加入新鮮AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至不同時(shí)點(diǎn)。

2.3 細(xì)胞周期的測(cè)定取腺病毒轉(zhuǎn)染后不同時(shí)點(diǎn)的T細(xì)胞，800×g離心10 min棄上清;PBS洗1次，800×g離心10 min棄上清;加0.5 mL PBS吹勻;用5 mL注射器將細(xì)胞吸起，用力打入5 mL 70%預(yù)冷乙醇中，4℃固定過(guò)夜;800×g離心15 min收集固定細(xì)胞，PBS洗2次;用0.4 mL PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至tube中輕輕吹打;加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 mg/L，37℃水浴消化30 min;加PI約50 μL至終濃度約為65 mg/L，在冰浴中避光染色30 min;經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)取腺病毒轉(zhuǎn)染后不同時(shí)點(diǎn)的Jurkat細(xì)胞，800×g離心10 min，棄上清;PBS洗1次，800×g離心10 min，棄上清;加2 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，800×g離心10 min，棄上清;加100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL Annexin V-PE，室溫避光孵育15 min;加入2 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，800×g離心10 min，棄上清;加500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL 7-AAD，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Jurkat細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5×105細(xì)胞，按所選MOI值加入腺病毒，未經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組;放置37℃培養(yǎng)48 h和72 h后，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，取4個(gè)孔的均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用方差分析(ANOVA)對(duì)組間差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Ad5針對(duì)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

Ad5-GFP轉(zhuǎn)染各種T細(xì)胞48 h后的效率見(jiàn)圖1。在MOI值相同時(shí)，Ad5-GFP對(duì)T淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高，并且隨著MOI值的升高，轉(zhuǎn)染效率隨之增加;當(dāng)MOI為400時(shí)，大約60%的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。Ad5-GFP對(duì)原代CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力大致相當(dāng)，轉(zhuǎn)染效率并未隨MOI值的升高而顯著增加;在MOI為400時(shí)，約15%的CD8+T細(xì)胞和約13%的CD4+T細(xì)胞表達(dá)GFP。當(dāng)外周血T細(xì)胞預(yù)先用CD3抗體和IL-2、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)等細(xì)胞因子刺激活化后，CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞所占比例有所提高，CD8+T為50%，CD4+T為32%(結(jié)果未顯示)，在MOI為400時(shí)，約9%的CD4+T細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染;經(jīng)刺激活化后，Ad5-GFP針對(duì)CD8+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯下降，在MOI為400時(shí)，僅4%的CD8+T細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。

Figure 1.The Ad5 transfection efficiencies for T cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs MOI 20 group.圖1 Ad5針對(duì)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率結(jié)果

2 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)位于細(xì)胞膜磷脂雙分子層的內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時(shí)，PS會(huì)發(fā)生外翻到細(xì)胞膜脂雙層外側(cè)，外翻的PS會(huì)被Annexin V結(jié)合，而染料7-AAD無(wú)法通過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，Annexin V+/7-AAD-細(xì)胞即為早期凋亡細(xì)胞;細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡時(shí)，染料7-AAD會(huì)穿過(guò)凋亡細(xì)胞膜上小孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，Annexin V+/7-AAD+細(xì)胞即為晚期凋亡細(xì)胞。Ad5-GFP轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)，利用Annexin V-PE/7-AAD檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，如圖2所示，相比未發(fā)生病毒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞，病毒轉(zhuǎn)染后早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞所占的比例均沒(méi)有出現(xiàn)明顯增加。圖2中還列出了病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞結(jié)合染料Annexin V-PE的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescent intensity，MFI)，該值反映出每個(gè)細(xì)胞所結(jié)合染料Annexin V的情況，細(xì)胞膜上發(fā)生外翻的PS越多，其MFI值就越大。在病毒轉(zhuǎn)染后的相同時(shí)點(diǎn)，隨著病毒MOI值的增加，其MFI值出現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。MFI值的減少也許與腺病毒通過(guò)細(xì)胞胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有關(guān)。

3 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

經(jīng)不同MOI值轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞，被植物血凝素刺激不同時(shí)間(48 h和72 h)后活細(xì)胞數(shù)目的變化情況見(jiàn)圖3。隨著刺激時(shí)間增加，所選MOI值轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞數(shù)目均有增加;在同一刺激時(shí)段，與未發(fā)生病毒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比較，各MOI值轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞數(shù)目未發(fā)現(xiàn)明顯下降，表明Jurkat細(xì)胞在被腺病毒轉(zhuǎn)染后，對(duì)外界刺激所具有的增殖能力并未受到影響。

4 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞周期影響

在病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后48 h和72 h，相對(duì)于未發(fā)生病毒轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照組細(xì)胞，處于G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例未見(jiàn)明顯變化，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯于某個(gè)時(shí)期，見(jiàn)表1。

討論

Ad5利用病毒纖毛頭節(jié)區(qū)結(jié)合細(xì)胞膜表面的柯薩奇-腺病毒受體(coxsackie-adenovirus receptor，CAR)完成病毒與靶細(xì)胞的吸附，然后通過(guò)病毒纖毛基底部五鄰體與靶細(xì)胞膜表面的整合素相互作用內(nèi)化到細(xì)胞中并進(jìn)入溶酶體，最后腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過(guò)核孔將病毒DNA釋放到細(xì)胞核內(nèi)［5］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ad5-GFP轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞的效率明顯高于原代T淋巴細(xì)胞，也許和Jurkat細(xì)胞表面的CAR與整合素的表達(dá)有關(guān);抗體和細(xì)胞因子刺激活化后的CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出更難以被Ad5-GFP轉(zhuǎn)染，或許是刺激活化導(dǎo)致細(xì)胞CAR與整合素的表達(dá)水平發(fā)生變化，也可能與病毒顆粒在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸效率有關(guān)［6］，有關(guān)Ad5在T細(xì)胞中運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Figure 2.The apoptosis of Jurkat cells after Ad5 transfection detected by flow cytometry and Annexin V/7-AAD staining.Mean±SD.n=3.MFI:mean fluorescent intensity.圖2 Ad5轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)所選擇的MOI值條件下，磷脂酰絲氨酸外翻細(xì)胞的所占比例未顯著提高，未發(fā)現(xiàn)Ad5轉(zhuǎn)染導(dǎo)致T細(xì)胞的顯著凋亡。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)病毒MOI值的增加導(dǎo)致單個(gè)細(xì)胞上磷脂酰絲氨酸外翻數(shù)目減少的現(xiàn)象，可能與腺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞胞吞進(jìn)入細(xì)胞的方式有關(guān)。以往研究結(jié)果表明膽固醇在腺病毒的胞吞過(guò)程中發(fā)揮重要作用［7］，磷脂酰絲氨酸是否在腺病毒的胞吞過(guò)程中起到重要作用以及具體參與方式等問(wèn)題，有待進(jìn)一步的研究。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及慢病毒載體是目前基因治療中最常用的2種病毒載體，但由于其滴度偏低、可能在淋巴細(xì)胞基因組內(nèi)隨機(jī)插入產(chǎn)生致瘤的風(fēng)險(xiǎn)，因此并不是TCR基因修飾T細(xì)胞過(guò)繼性治療中的理想載體［8］。本研究對(duì)Ad5轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞的效率以及細(xì)胞毒性進(jìn)行了初步的分析，發(fā)現(xiàn)Ad5轉(zhuǎn)染原代T淋巴細(xì)胞的效率偏低，以往研究結(jié)果表明增加病毒轉(zhuǎn)染的MOI值將會(huì)有效提高病毒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的能力［9］，因此可以采用提高M(jìn)OI值的方法提高Ad5轉(zhuǎn)染原代T細(xì)胞的效率;在細(xì)胞周期檢測(cè)中，未發(fā)現(xiàn)Ad5轉(zhuǎn)染引起細(xì)胞周期阻滯;在活細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，T細(xì)胞對(duì)刺激的活化增殖能力未受到Ad5轉(zhuǎn)染的影響，表明Ad5介導(dǎo)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的低細(xì)胞毒性。綜上所述，Ad5腺病毒載體是TCR基因治療的一種合適載體，在以后的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

Figure 3.The effects of transfection with Ad5 on the proliferation of Jurkat cells.Mean±SD.n=5.圖3 Ad5轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

表1 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞周期分析結(jié)果Table 1.The effects of transfection with Ad5 on the cell cycle of T lymphocytes(Mean±SD.n=3)

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Transfection efficiency and cytotoxicity in human T lymphocytes infected with Ad5 adenoviral vector

ZHANG Wen-feng1，2，ZHANG Qiong-yu3，SHAO Hong-wei1，2，WU Feng-lin1，2，WANG Teng1，2，HUANG Shu-lin1，2
(1School of Life Science＆Biopharmacology，2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology Candidate Drug Research，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China;3Department of Basic Medical Science，Yongzhou Vocational Technical College，Yongzhou 425100，China.E-mail:shulhuang@sina.com)

AIM:To determine the transfection efficiencies and to evaluate the cytotoxicity of infection with Ad5 adenoviral vector in human T lymphocytes.METHODS:The T-lymphoma Jurkat cell line，normal CD3+T cells and pre-stimulated CD3+T cells were transfected with Ad5 adenovirus at multiplicities of infection(MOI)ranging from 20 to 400.GFP expression was analyzed by flow cytometry 48 h after transfection.The cells were harvested 24 h，48 h and 72 h after transfection.The cell cycle was analyzed using propidium iodide staining and the apoptosis of T lymphocytes was detected by annexin V/7-AAD staining.Trypan blue exclusion assay was used to determine the survival cell numbers after 48 h or 72 h of transfection.RESULTS:The transfection of primary human T cells by the Ad5 virus was less efficient than that of a T-lymphoma cell line.Similar transfection efficiency was observed in both CD4+T lymphocytes and CD8+T lymphocytes.The activation of T lymphocytes resulted in a decrease in Ad5 transfection efficiency in CD8+T cells.Following transfection(24 h，48 h and 72 h)，the percentages of G0/G1-phase cells，S-phase cells，G2/M-phase cells and apoptotic cells at all MOI did not change significantly.Therefore，transfection by the Ad5 adenoviral vector did not influence the cell cycle and survival cell numbers.CONCLUSION:The Ad5 adenoviral vector，which shows little cytotoxicity to T lymphocytes，may be a valuable tool for T cell receptor gene therapy.

Adenoviral vector;T lymphocytes;Cytotoxicity

1000-4718(2014)02-0318-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.022

2013-09-05

2013-12-23

科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)“十一五”計(jì)劃項(xiàng)目(No.2009ZX09103-708);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31100664;No.31300737;No.81303292);東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011105102027)

△通訊作者Tel:020-39352201;E-mail:shulhuang@sina.com