2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PEDF與TNF-α水平的變化*

呂秋菊，唐喜香，丘雅維，曾可靜，穆攀偉，陳燕銘，曾龍?bào)A

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，廣東廣州 510630)

2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PEDF與TNF-α水平的變化*

呂秋菊，唐喜香，丘雅維，曾可靜，穆攀偉，陳燕銘△，曾龍?bào)A

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，廣東廣州 510630)

目的:色素上皮衍生因子(PEDF)是影響糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)發(fā)生發(fā)展的重要因子，本研究觀察2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中PEDF、磷酸化NF-κB p65及TNF-α的表達(dá)，探討DR的發(fā)病機(jī)制。方法：選取2011年10月～2013年4月在我院內(nèi)分泌科住院確診為2型糖尿病的患者(DM組)108例，并根據(jù)眼底造影結(jié)果將患者分為無糖尿病視網(wǎng)膜病變組(NDR組)52例和糖尿病視網(wǎng)膜病變組(DR組)56例，同期糖耐量實(shí)驗(yàn)正常者52例作為對(duì)照組(NC組)。密度梯度離心法收集患者PBMCs，提取總蛋白，Western blotting檢測(cè)3組患者PBMCs中PEDF、磷酸化NF-κB p65和TNF-α蛋白表達(dá)水平，ELISA測(cè)定血漿PEDF與TNF-α水平，收集患者體檢指標(biāo)并測(cè)量患者生化指標(biāo)。結(jié)果:Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示NDR組和DR組PEDF、磷酸化NF-κB p65和TNF-α蛋白水平明顯高于NC組(P＜0.05);DR組TNF-α蛋白水平明顯高于NDR組(P＜0.05)，DR組PEDF及磷酸化NF-κB p65蛋白水平略高于NDR組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);NDR組和DR組血漿PEDF與TNF-α水平均明顯高于NC組(P＜0.05)，DR組明顯高于NDR組(P＜0.05)。在糖尿病組，血漿PEDF水平與TNF-α及血尿酸水平呈正相關(guān)(r=0.39，r=0.25，P＜0.05)。結(jié)論:本研究首次證實(shí)PBMCs中可表達(dá)PEDF;2型糖尿病患者PBMCs中PEDF表達(dá)水平增加，TNF-α及血漿PEDF的表達(dá)水平上調(diào)，PEDF可能通過與炎癥因子TNF-α相互作用影響DR發(fā)生發(fā)展。

色素上皮衍生因子;外周血單個(gè)核細(xì)胞;糖尿病視網(wǎng)膜病

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，是當(dāng)今勞動(dòng)適齡人口致盲的主要原因之一。明確DR發(fā)病機(jī)制對(duì)預(yù)防和控制DR有重要作用。近年來，大量研究認(rèn)為，早期DR的發(fā)生發(fā)展與局部慢性低度炎癥狀態(tài)密切相關(guān)［1］。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)主要由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞組成，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。DR逐漸發(fā)生時(shí)，PBMCs炎癥狀態(tài)是否發(fā)生改變，目前報(bào)道甚少。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是一種分子量為50 kD的分泌型糖蛋白，其作用與DR發(fā)生過程中血管新生和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。PEDF主要由肝臟和脂肪細(xì)胞［2］分泌，在糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生過程中起著重要作用，目前尚未見任何關(guān)于PBMCs分泌PEDF的報(bào)道。本研究旨在探討DR患者與非糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-diabetic retinopathy，NDR)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PEDF、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB(phosphorylated nuclear factor κB，p-NF-κB)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)蛋白表達(dá)的差異，為DR與炎癥之間關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步深入的探討提供線索。

材料和方法

1 研究對(duì)象及材料

1.1 對(duì)象選取我院2011年10月～2013年4月診斷為2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)的患者108例，其中男55例，女53例，年齡(59.3±9.7)歲，糖尿病診斷符合WHO 1999年標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)眼底熒光血管照影和眼底檢查結(jié)果，將糖尿病患者分為2組:糖尿病不合并視網(wǎng)膜病變患者(NDR組)52例，年齡(56.3±7.1)歲，糖尿病合并視網(wǎng)膜病變患者(DR 組)56例，年齡(62.2±10.9)歲。正常對(duì)照(normal control，NC)組選擇體檢健康者52例，男23例，女29例，年齡(56.4±11.8)歲，無心臟病、高血壓，口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)排除糖尿病。研究對(duì)象均無明確的心、肝、肺及腎臟疾病，排除急、慢性感染性疾病及惡性腫瘤等。

1.2 材料與試劑Lymphoprep人淋巴細(xì)胞分離液購自達(dá)科為公司;細(xì)胞裂解液購自廣州捷倍斯公司;蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自Pierce;PVDF膜購自Millipore;兔抗人PEDF多抗購自Santa Cruz，兔抗人磷酸化NF-κB p65單抗、兔抗人TNF-α單抗和β-actin單抗均購自Cell Signaling Technology。熒光標(biāo)記的羊抗兔II抗購自O(shè)dyssey。

2 方法

2.1 一般檢查對(duì)所有受試者詢問病史、家族史、吸煙史，測(cè)量血壓、心率、身高、體重等，檢測(cè)血常規(guī)和尿常規(guī)。

2.2 血漿PEDF及TNF-α水平檢測(cè)血漿PEDF及TNF-α水平采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定，試劑盒購自Millipore和安迪生物科技上海有限公司，操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書的要求步驟進(jìn)行。

2.3 Western blotting檢測(cè)PBMCs中PEDF、TNF-α 和p-NF-κB p65(Ser536)蛋白水平收集病人清晨空腹靜脈血3 mL，2 h內(nèi)以Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離PBMCs，加入細(xì)胞裂解液后，4℃、16 000×g離心15 min取上清液即可得總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，配平蛋白濃度。每樣品取15 μL上樣，SDS-PAGE約2 h，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉或5%BSA室溫封閉2 h，加入兔抗人PEDF多抗、兔抗人p-NF-κB p65單抗、兔抗人TNF-α單抗或兔抗人β-actin單抗(1∶1 500) 4℃過夜。經(jīng)熒光標(biāo)記的羊抗兔II抗(1∶10 000)室溫孵育1 h后洗膜，將膜置于Odyssey近紅外光熒光掃描儀上進(jìn)行掃描。以目的蛋白與β-actin條帶吸光度值之比表示目的蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0分析，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，非正態(tài)數(shù)據(jù)以中位數(shù)(第1四分位數(shù)，第3四分位數(shù))［median(Q1，Q3)］表示。對(duì)于符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。對(duì)于非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 臨床基本資料

3組間患者性別及年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);DR組血尿酸(serum uric acid，SUA)水平較NC組及NDR組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DR組和NDR組白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù)較NC組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組臨床資料與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)Table 1.Clinical and experimental characteristics among the three groups

2 PBMCs中p-NF-κB p65(Ser536)、PEDF和TNF-α蛋白的表達(dá)水平

PBMCs可表達(dá)p-NF-κB p65(Ser536)、PEDF和TNF-α蛋白。NDR組和DR組患者PBMCs中p-NF-κB p65(Ser536)蛋白水平顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DR組患者PBMCs中p-NF-κB p65(Ser536)蛋白水平略高于NDR組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。NDR組及DR組患者PBMCs 中PEDF蛋白水平明顯高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DR組略高于NDR組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。NDR組及DR組患者PBMCs中TNF-α蛋白水平明顯高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，DR組明顯高于NDR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

3 血漿PEDF與TNF-α水平

血漿PEDF水平在NDR組［(2.46±0.71)mg/ L］和DR組［(2.82±0.62)mg/L］明顯高于NC組［(2.04±0.65)mg/L］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，DR組明顯高于NDR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。血漿TNF-α水平在NDR組［(66.72± 21.18)ng/L］和DR組［(78.03±23.30)ng/L］明顯高于NC組［(53.82±23.69)ng/L］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，DR組明顯高于NDR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

4 相關(guān)性分析

患者血漿PEDF水平與TNF-α及SUA水平均呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.39和0.25，P＜0.05)。血漿PEDF水平與患者年齡無明顯相關(guān)性。

Figure 1.Protein levels of p-NF-κB p65(Ser536)，PEDF and TNF-α in PBMCs among the three groups.NC:normal control subjects(n=52);NDR:non-diabetic retinopathy patients(n=52);DR:diabetic retinopathy patients(n=56).Mean±SD.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs NDR group.圖1 各組PBMCs中p-NF-κB p65(Ser536)、PEDF和TNF-α蛋白的表達(dá)水平

討論

PEDF是1989年Tombran-Tink等［3］首次從胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中提取出的一種蛋白因子，是由418個(gè)氨基酸構(gòu)成的分泌性糖蛋白，分子量約50 kD，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，但并不具有抑制劑活性。PEDF是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的拮抗因子，除了其強(qiáng)烈的抗血管新生作用［4］之外，其抗炎作用也逐漸受到重視［2，5］。Zhang等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變及氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠玻璃體內(nèi)注射PEDF后，炎癥因子水平如VEGF、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)等均下降，而小分子RNA干擾PEDF表達(dá)后，炎癥因子水平上升。近年多項(xiàng)研究提示，DR的發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥密切相關(guān)［7］。PBMCs主要由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞組成，T淋巴細(xì)胞激活，可直接損傷胰島細(xì)胞，促發(fā)1型糖尿病［8］;過度肥胖時(shí)，單核細(xì)胞激活后轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，聚集到脂肪組織釋放如TNF-α、白細(xì)胞介素6 (interleukin-6，IL-6)等炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)和參與炎癥反應(yīng)，引起胰島素抵抗，逐漸進(jìn)展為2型糖尿病。隨著炎癥介質(zhì)刺激的累積，視網(wǎng)膜血管損傷、增生，進(jìn)而發(fā)展為視網(wǎng)膜病變［9］。因此，PBMCs是研究糖尿病發(fā)生機(jī)制的重要對(duì)象。本研究首次發(fā)現(xiàn)，PEDF可表達(dá)于人PBMCs，并在糖尿病患者PBMCs中明顯增高，且DR組高于NDR組。同時(shí)DR組和NDR組血漿PEDF水平明顯高于NC組，與PBMCs蛋白表達(dá)水平趨勢(shì)一致，但DR組血漿PEDF水平明顯高于NDR組，可能由于血漿中PEDF是所有分泌器官分泌PEDF的總和，PBMCs分泌的PEDF量只占其中一部分，因此差異不如血漿PEDF變化顯著。另2項(xiàng)日本的人群研究發(fā)現(xiàn)［10-11］，NDR組血清PEDF與NC組及DR組差異不明顯，可能是2項(xiàng)研究中NDR組的樣本量均較少(＜18例)有關(guān)。結(jié)合我們的研究分析，PBMCs是分泌PEDF的重要器官，其PEDF分泌量的變化可能影響血漿PEDF濃度，并隨著糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生而逐漸升高。這提示血漿PEDF在2型糖尿病組尤其糖尿病視網(wǎng)膜病變組明顯增高可能預(yù)示糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展。

Figure 2.Levels of PEDF and TNF-α in plasma among the three groups.NC:normal control subjects(n=52);NDR: non-diabetic retinopathy patients(n=52);DR:diabetic retinopathy patients(n=56).Mean±SD.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs NDR group.圖2 各組血漿PEDF和TNF-α水平

NF-κB p65是核轉(zhuǎn)錄因子蛋白NF-κB的亞基，在炎癥反應(yīng)中起重要作用，以二聚體的形式與其抑制因子IκB結(jié)合以無活性的形式存在于胞漿中，炎癥、營養(yǎng)過剩、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種因素激活NF-κB p65，激活的NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核，增強(qiáng)多種炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而產(chǎn)生的細(xì)胞因子如TNF-α反過來激活NF-κB p65，形成正反饋，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，新診斷2型糖尿病患者PBMCs中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組［13］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)糖尿病患者PBMCs中p-NF-κB p65 和TNF-α蛋白表達(dá)水平在DR組高于NDR組。TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，而單核細(xì)胞是PBMCs的主要組成部分，PBMCs激活時(shí)TNF-α分泌增多。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，DR患者血清TNF-α水平較NDR患者明顯升高［14］，與本實(shí)驗(yàn)PBMCs中TNF-α趨勢(shì)相同，提示DR患者較NDR患者處于更嚴(yán)重的炎癥狀態(tài)，這種炎癥狀態(tài)的加重可能與PBMCs激活有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，血漿PEDF水平與TNF-α及SUA呈正相關(guān)。其中，TNF-α是重要的炎癥介質(zhì)［15］，尿酸被認(rèn)為與慢性低度炎癥呈正相關(guān)［16］。本研究結(jié)果提示血漿PEDF可能隨炎癥程度的加重而升高。

糖尿病是一種慢性炎癥性疾病，隨著長(zhǎng)期高糖刺激，糖尿病患者微血管結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，逐步發(fā)展為DR。多項(xiàng)研究提示炎癥參與了DR的發(fā)病機(jī)制。本研究中，隨著DR的發(fā)生，PBMCs中炎癥轉(zhuǎn)錄因子p-NF-κB p65及炎癥因子TNF-α蛋白表達(dá)水平升高，提示PBMCs炎癥狀態(tài)的改變可能與DR的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而這種炎癥狀態(tài)的改變可能是由于各種因素如長(zhǎng)期高糖、血糖波動(dòng)、缺血缺氧等刺激PB-MCs中NF-κB p65磷酸化激活炎癥通路引起的;PBMCs中PEDF表達(dá)隨TNF-α的上升而增高，可能是炎癥激活某種通路的結(jié)果，具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。同時(shí)，血漿PEDF水平升高，與具促炎效應(yīng)的SUA及TNF-α呈正相關(guān)，說明PEDF與炎癥關(guān)系密切。但其在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病過程中與炎癥的關(guān)系尚不明確。多項(xiàng)研究表明，PEDF具有抗炎作用，PEDF過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)，高氧誘導(dǎo)缺血性視網(wǎng)膜病變和激光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病理血管增生時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜缺血缺氧程度及炎癥因子表達(dá)水平均明顯低于野生型小鼠［17］，而PEDF基因敲除小鼠則出現(xiàn)相反的表現(xiàn)［18］，提示PEDF通過抑制炎癥及視網(wǎng)膜血管新生延緩視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展。而一些臨床研究結(jié)果表明，PEDF與血清炎癥因子水平呈正相關(guān)［19］，可能是由于機(jī)體的代償反應(yīng)機(jī)制，即DR期炎癥因子分泌的增加引起機(jī)體對(duì)PEDF需求量增加，從而代償性升高以拮抗炎癥反應(yīng)。而DR發(fā)生時(shí)，由于視網(wǎng)膜血管閉塞及缺血，導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部血流減少，致視網(wǎng)膜PEDF量下降。PBMCs在此過程中可能起著重要作用，其主要成分單核細(xì)胞在活化時(shí)可到達(dá)視網(wǎng)膜局部釋放PEDF，抑制視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。而視網(wǎng)膜局部血流量下降時(shí)，所能激活的PBMCs數(shù)量有限，導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部PEDF水平下降。這可能是DR患者視網(wǎng)膜局部PEDF減少而外周血PEDF升高的原因。但引起外周血PEDF增高的具體機(jī)制及PEDF與NF-κB p65活化及TNF-α之間的因果關(guān)系尚需進(jìn)行下一步深入研究。

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Levels of PEDF and TNF-α in PBMCs of type 2 diabetic retinopathy patients

Lü Qiu-ju，TANG Xi-xiang，QIU Ya-wei，ZENG Ke-jing，MU Pan-wei，CHEN Yanming，ZENG Long-yi
(Department of Endocrinology＆Metabolism，The Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China.E-mail:yanmingch@tom.com)

AIM:To investigate the roles of pigment epithelium-derived factor(PEDF)，phosphorylated NF-κB p65 and TNF-α in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)in diabetic retinopathy(DR)patients.METHODS:Fifty-two healthy persons were enrolled in the study as normal control group(NC group).Type 2 diabetic patients served as DM group(n=108)，which were sub-divided into non-diabetic retinopathy group(NDR group，n=52)and diabetic retinopathy group(DR group，n=56)by angiography.The PBMCs were isolated by the technique of density-gradient centrifugation.The protein levels of PEDF，phosphorylated NF-κB p65 and TNF-α in the PBMCs were determined by Western blotting.The levels of plasma PEDF and TNF-α were detected by ELISA.The content of serum uric acid(SUA)and white blood cell count were measured.RESULTS:The levels of PEDF，TNF-α and phosphorylated NF-κB p65 in the PBMCs were statistically higher in NDR group and DR group than those in control group.The level of TNF-α increased significantly in DR group as compared with NDR group.The levels of PEDF and phosphorylated NF-κB p65 were slightly but not significantly higher in DR group than those in NDR group.The plasma levels of PEDF and TNF-α were evidently elevated in NDR group and DR group compared with NC group，and those were obviously higher in DR group than those in NDR group.In the diabetic patients，the plasma level of PEDF was positively correlated with the levels of TNF-α(r=3.39，P＜0.05) and SUA(r=0.25，P＜0.05).CONCLUSION:The expression of PEDF in PBMCs is markedly increased，accompanied with the elevation of phosphorylated NF-κB p65 and TNF-α in type 2 diabetic patients especially with DR，suggesting that PEDF is possibly involved in the development of DR by inflammatory mechanism.

Pigment epithelium-derived factor;Peripheral blood mononuclear cells;Diabetic retinopathy

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.020

1000-4718(2014)02-0308-05

2013-09-26

2013-12-30

廣東省科技計(jì)劃(No.2011B031800155);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2011010004811)

△通訊作者Tel:020-85253408;E-mail:yanmingch@tom.com