KIR基因多態(tài)性影響腎移植受者微量巨細(xì)胞病毒和BK病毒DNA的研究*

吳琦，陳孝倩，王天陽，陳景鋒，潘曉東，吳存造，夏鵬，陳必成△，楊亦榮△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院器官移植中心，浙江溫州 325000;2麗水市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江麗水 323000)

KIR基因多態(tài)性影響腎移植受者微量巨細(xì)胞病毒和BK病毒DNA的研究*

吳琦1，2，陳孝倩1，王天陽1，陳景鋒1，潘曉東1，吳存造1，夏鵬1，陳必成1△，楊亦榮1△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院器官移植中心，浙江溫州 325000;2麗水市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江麗水 323000)

目的:探討腎移植受者殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因多態(tài)性對腎移植術(shù)后微量巨細(xì)胞病毒(CMV)和BK病毒(BKV)DNA的影響。方法：采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)法檢測48例腎移植受者KIR基因多態(tài)性。依照不同功能的KIR單倍體，將KIR基因組合型分為抑制型KIR基因組合型(AA型)和非抑制型KIR基因組合型(BX型，包括BB型和AA型)。采用實時熒光定量PCR法檢測腎移植術(shù)的受者血清DNA中CMV和BKV的載量。分析AA和BX KIR基因型對腎移植術(shù)后1年內(nèi)CMV和BKV DNA血癥累積陽性率及血肌酐的影響。結(jié)果:不同KIR基因型間，免疫抑制劑濃度無明顯差異(P＞0.05)。相較KIR-BX基因型，KIRAA基因型的BKV累積陽性率明顯增加(P＜0.05);而KIR兩型間，CMV病毒血癥的發(fā)生率沒有明顯差異(P＞0.05)。KIR-AA型術(shù)后1～12月平均血肌酐水平較BX型低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);經(jīng)3年隨訪，KIR-AA型受者血肌酐水平低于BX型(P＜0.05)，而2組間血尿素氮和尿酸水平無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:KIR-AA基因型腎移植受者術(shù)后1年內(nèi)BKV DNA血癥增加，而不影響CMV DNA血癥。

殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體;基因多態(tài)性;腎移植;巨細(xì)胞病毒;BK病毒

殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobin-like receptor，KIR)是一類存在于自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)和某些T細(xì)胞表面上，其進(jìn)化快速并呈高度多態(tài)性的受體家族［1］。KIR特異性識別人白細(xì)胞抗原I類分子(human leukocyte antigen class I antigen，HLA-I)，進(jìn)而調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性。已發(fā)表少量文獻(xiàn)認(rèn)為KIR在移植后病人潛伏病毒的再次感染中起重要作用。巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)與BK病毒(BK virus，BKV)是在正常人以潛伏感染存在、但對腎移植受者預(yù)后有重要影響的DNA病毒。免疫抑制不足可以導(dǎo)致移植物排斥反應(yīng)的發(fā)生，而免疫抑制過度卻會導(dǎo)致CMV和BKV再感染或復(fù)燃。條件感染病毒其活躍狀態(tài)與個體免疫狀態(tài)密切相關(guān)，不同個體的遺傳背景對免疫抑制治療反應(yīng)不同。為深入了解個體化醫(yī)療在免疫抑制治療與病毒感染關(guān)系中的意義，我們探討了KIR基因多態(tài)性對CMV-BKV感染的影響。

材料和方法

1 實驗對象

48例于2009年12月～2010年6月間在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院本院行尸體腎移植術(shù)的受者，在腎移植術(shù)后10 d起至術(shù)后3個月均口服萬賽維片(纈更昔洛韋片，上海羅氏制藥)，劑量為900 mg (qd)，未有因出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)、肝功能受損及其它藥物副作用而停藥的受者，服藥依從性佳，CMV-pp65檢測結(jié)果均為陰性，以他克莫司(tacrolimus， FK506)、嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil，MMF)和甲基強(qiáng)的松龍(methylprednisolone，MP)為主要免疫抑制方案，隨訪時間1年，均未發(fā)生急性排斥反應(yīng)。其中男35例，女13例，平均年齡(42.30± 10.17)歲，性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，共采集血液標(biāo)本數(shù)257份，予實時定量PCR(real-time PCR)檢測CMV-BKV的DNA拷貝以及KIR基因多態(tài)性。

2 方法

2.1 基因組DNA提取抽取患者外周血2 mL，用EDTA·K2抗凝，采用核酸提取試劑盒提取外周血總DNA(上海飛捷公司)，并將提取的DNA置于-20℃保存，備用。

2.2 KIR基因檢測采用KIR基因分型檢測試劑盒(天津秀鵬公司)提供的序列特異性引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR with sequence-specific primers，PCR-SSP)方法進(jìn)行基因分型。本實驗檢測的KIR基因包括KIR2DL1～5、2DS1～5、3DL1～3、3DS1、3DP1和2DP1。根據(jù)GenBank的16個KIR基因序列設(shè)計上、下游引物，并行BLAST驗證。根據(jù)人類生長激素基因的保守片段設(shè)計內(nèi)參照引物進(jìn)行擴(kuò)增。取試劑盒配套濃縮Buffer 70 μL，加去離子水90 μL，Taq DNA酶6U和10 mL DNA。再向16個孔中各加入10 μL上述混合液。PCR反應(yīng)條件:96℃2 min;96 ℃20 s，62℃60 s，72℃45 s，35個循環(huán);72℃5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，見圖1。

Figure 1.Electrophoretogram of PCR product of KIR gene.圖1 KIR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3KIR基因型分型參照WHO-KIR命名委員會2002年的報告［2］，將14個KIR功能基因組合劃定為抑制型(AA型)和非抑制型(BB和AB型)。抑制型是由多個抑制型KIR基因(2DL1，2DL3～4，3DL1～3)和單個活化型基因(2DS4)組成。非抑制型BB型由上述多個抑制型KIR基因與除2DS4外的多個活化型KIR基因(2DS1～3，2DS5，3DS1)組成;而AB型則由上述多個抑制型KIR基因和含有2DS4的多個活化型KIR基因(2DS1～5，3DS1)組成。此外，可將KIR基因型進(jìn)行編序，以基因型ID來歸納。KIR基因型ID的判斷可通過對照分析國際等位基因網(wǎng)站(http://www.allelefrequencies.net)公布的KIR基因型ID數(shù)據(jù)。

2.4 Real-time PCR技術(shù)同時檢測移植患者全血CMV和BKV的DNA載量采用的實時熒光定量試劑盒由本院外科實驗室提供，已申請專利(專利號為201010244873.9)［3］，選擇最為保守性序列作為靶檢測序列，上、下游引物和探針由上海基康公司合成。Real-time PCR最適反應(yīng)體系(10 μL):25 mmol/L MgCl21.5 μL，10 μmol/L上、下游引物以及探針混合液1.0 μL，25 mmol/L dNTP的混合液0.2 μL，10×EasyTaq緩沖液1.2 μL，5×106U/L EasyTaq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1.0 μL。最佳反應(yīng)條件為:95℃2 min，95℃10 s，62℃40 s，共45個循環(huán)，熒光值在62℃檢測。通過熒光定量PCR儀的分析軟件，記錄不同標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本的CMV和BKV的DNA拷貝數(shù)。根據(jù)試劑盒說明書，將BKV或CMV病毒載量大于1×106copies/L定義為陽性結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件分析，服從正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用Kaplan-Meier法估計累積風(fēng)險函數(shù)及l(fā)og-rank檢驗分析CMV和BKV DNA血癥腎移植術(shù)后1年內(nèi)的累積陽性率在不同KIR基因型中的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 免疫抑制藥物濃度檢測結(jié)果

受者移植術(shù)后的免疫抑制強(qiáng)度是影響條件性病原體感染的最主要因素，而移植術(shù)后第1年的免疫抑制劑用量最大。對同個腎移植受者1～12月的平均FK506藥物濃度比較后發(fā)現(xiàn)，2組受者藥物濃度差異并無統(tǒng)計學(xué)意義:AA型FK506平均濃度為(6.071±1.113)μg/L和BX型(包括AB和BB亞型)PK506平均濃度為(6.444±1.050)μg/L。

2 CMV-BKV檢測結(jié)果

在48例腎移植受者中，根據(jù)KIR基因組合型分為AA型和BX型，其中AA型17例，BX型31例，48例受者中共涉及257份血液標(biāo)本。CMV和BKV DNA陽性結(jié)果見表1。腎移植術(shù)后1年內(nèi)CMV和BKV出現(xiàn)病毒血癥的累積陽性率分別為40.1%和11.3%，見表2。

表1257 份腎移植受者CMV-BKV陽性結(jié)果Table 1.CMV-BKV DNA results of 257 blood samples from transplant recipients

表2 不同KIR基因型腎移植術(shù)后1年內(nèi)累積CMV-BKV陽性數(shù)(率)Table 2.The cumulative positive incidence of CMV-BK DNA in the first year after renal transplantation

3 KIR基因型與CMV-BKV累積陽性率

腎移植術(shù)后病毒血癥發(fā)生有波動性，單一時點(diǎn)病毒血癥陽性率進(jìn)行比較容易產(chǎn)生偏倚。因此以腎移植術(shù)后1年內(nèi)患者血清中出現(xiàn)病毒DNA復(fù)制作為事件，采用Kaplan-Meier法來分析不同的KIR基因型對CMV-BKV病毒血癥發(fā)生率的影響，并采用log-rank檢驗2組差異。本實驗中，不同KIR基因型對CMV病毒血癥的發(fā)生無明顯差異(P＞0.05)，而BX型BKV累積陽性率低于AA型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);見圖2、3。

4 腎功能檢測結(jié)果

48例腎移植受者腎移植術(shù)后1年內(nèi)與3年內(nèi)隨訪手冊所記錄的腎功能數(shù)據(jù)，包括血尿素氮、肌酐和尿酸，比較1～12月平均值，不同KIR基因型比較后發(fā)現(xiàn)，AA型術(shù)后1～12月平均血肌酐水平較BX型低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而血尿素氮和尿酸水平2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在移植后第3年，比較2組受者的血肌酐平均值，不同KIR基因型間存在顯著的差別，AA型術(shù)后3年平均血肌酐水平較BX型低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而血尿素氮和尿酸水平2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

Figure 2.The scatter diagram(A)and hazard function(B)of the cumulative positive incidence of CMV DNA of different KIR genotypes.圖2 KIR基因型與CMV DNA累積陽性率散點(diǎn)圖及危險函數(shù)

Figure 3.The scatter diagram(A)and hazard function(B)of the cumulative positive incidence of BK DNA of different KIR genotypes.圖3 KIR基因型與BKV DNA累積陽性率散點(diǎn)圖及危險函數(shù)

表3 KIR基因型與腎移植術(shù)后1年和3年內(nèi)腎功能指標(biāo)的比較Table 3.Parameters of renal function in the first year and three years after renal transplantation(Mean±SD)

討論

巨細(xì)胞病毒和BK病毒在初次感染產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，處于潛伏狀態(tài)，健康人群外周血中無微量病毒DNA復(fù)制。個體的免疫狀態(tài)是決定復(fù)燃的主要因素［4］，腎移植術(shù)后由于難以評估免疫狀態(tài)，常因免疫抑制劑的過度應(yīng)用，導(dǎo)致免疫功能過度下降，繼而引發(fā)潛伏病毒的DNA復(fù)制，引起嚴(yán)重的感染，危及移植腎功能及腎移植受者生命。CMV是導(dǎo)致腎移植受者死亡和移植腎失功的主要病原體之一，而多瘤病毒屬的BKV病毒因其泌尿系毒性和易致BKV腎病造成移植腎失功。

我們前期發(fā)現(xiàn)某些低免疫抑制個人也會發(fā)現(xiàn)微量CMV-DNA，可見個體的遺傳背景影響免疫抑制狀態(tài)。細(xì)胞因子可顯著影響免疫功能，但腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細(xì)胞介素2 (interleukin-2，IL-2)、IL-10、IL-12多態(tài)性均未發(fā)現(xiàn)與CMV感染有關(guān)［5-6］。免疫細(xì)胞中，NK細(xì)胞不需預(yù)先致敏就能對病毒感染細(xì)胞發(fā)揮直接殺傷作用，這一反應(yīng)雖然快速但其中涉及的調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜。KIR作為NK細(xì)胞上重要的受體之一，是機(jī)體抗病毒的重要因素［7-8］，針對其調(diào)控的方式有NK細(xì)胞殺傷功能發(fā)揮的“missing-self”假說［9］和自身細(xì)胞耐受NK細(xì)胞殺傷的“l(fā)icensing”假說［10］。NK細(xì)胞的殺傷功能通過KIR的抑制性和活化性信號的平衡來實現(xiàn)，根據(jù)假說推定:越多的KIR活化性基因，更有利于對病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。因此本實驗將KIR基因型分為抑制性KIR-AA基因型和非抑制性KIR-BX型，分析不同KIR型別是否影響腎移植受者外周血出現(xiàn)CMV/BKV微量DNA［11］。

由于CMV和BKV感染早期缺乏特異性，臨床常用CMV-pp65和CMV-DNA檢測作為早期診斷的指標(biāo)，而實時熒光定量PCR檢測病毒微量DNA更易進(jìn)行定量檢測。高拷貝血漿CMV-DNA載量與CMV發(fā)病有關(guān)，血漿中BKV-DNA載量和BKV腎病的損害程度密切相關(guān)［12］，我們采用同時檢測血液中此2種病毒DNA載量來評價受者免疫抑制狀態(tài)?；跓晒舛縋CR的高敏感性，為了進(jìn)一步減少實驗干擾因素，我們納入術(shù)前CMV-pp65檢測陰性的腎移植受者，并篩除發(fā)生急性排斥反應(yīng)的受者，所有實驗對象均采用FK506+MMF+MP免疫抑制方案，且采用腎移植術(shù)后1年內(nèi)累積感染率來研究KIR基因和CMV-BKV DNA病毒載量動態(tài)變化的關(guān)系，我們研究發(fā)現(xiàn)了KIR-BX基因型在腎移植術(shù)后BKV感染中存在“劑量依賴”式的作用，即擁有越多的活化KIR基因的受者，其移植術(shù)后發(fā)生BKV感染的可能性越低，此前國外關(guān)于KIR和BKV的研究未發(fā)現(xiàn)兩者有明顯相關(guān)，這可能和樣本數(shù)量和實驗設(shè)計方面差異有關(guān)。

KIR與CMV的初期研究主要集中在造血干細(xì)胞移植中，Gallez-Hawkins等［13］發(fā)現(xiàn)CMV的感染率和KIR2DS2和2DS4基因表達(dá)相關(guān)。近年來在腎移植領(lǐng)域，類似研究逐漸成為熱點(diǎn)，CMV和KIR基因的研究中發(fā)現(xiàn)活性化KIR基因的數(shù)量和腎移植術(shù)后CMV感染和復(fù)燃發(fā)生率負(fù)相關(guān)［14-15］，Stern等［16］關(guān)于KIR基因與著絲粒位置的進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn)，著絲粒近端的KIR活化基因比著絲粒遠(yuǎn)端的活化性KIR基因與CMV病毒血癥發(fā)生的關(guān)系更為密切，這些都為本實驗奠定了基礎(chǔ)，但在本實驗中血CMVDNA的出現(xiàn)與KIR基因無明顯相關(guān)，原因可能與前3個月采用了CMV預(yù)防性治療、樣本量較少及本中心免疫抑制藥物用量較少有關(guān)。

KIR基因在慢性腎衰竭尿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中的報道尚少，其具體機(jī)制也尚未明確。國內(nèi)外研究表明，HLA配體結(jié)合KIR受體對NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)，推測在終末期腎病的病理生理過程中可能起到一定的作用，但單純從KIR基因多態(tài)性角度分析并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性［17］。在腎移植后，當(dāng)受者有較多的活化型KIR與供者的HLA-I類分子相匹配時，相對于抑制性KIR受者的NK細(xì)胞對供腎的殺傷作用更強(qiáng)，導(dǎo)致術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的概率增加［18］。本研究對未出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的受者進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)，隨訪1年AA型(抑制型)受者的血肌酐濃度低于BX型受者。隨訪3年也得出相同結(jié)果。此研究證實雖然KIR抑制型受者外周血更易出現(xiàn)微量BK病毒DNA，但并不顯著影響移植腎的的功能，反而可能因較弱的NK細(xì)胞作用而對移植腎有保護(hù)作用。

總而言之，我們的實驗發(fā)現(xiàn)了KIR-BX基因型對腎移植術(shù)后1年內(nèi)BKV病毒的感染發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)，此結(jié)果與Trydzenskaya等［19］報道一致。支持了KIR作為遺傳背景之一影響了抗病毒免疫［20］，提示KIR-AA基因型受者需加強(qiáng)病毒檢測及相對減弱免疫抑制治療強(qiáng)度。同時，KIR-BX受者具較弱的NK細(xì)胞排斥反應(yīng)可能使這些受者獲益。

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Polymorphisms of KIR gene and CMV-BKV DNA quantification in renal transplant recipients

WU Qi1，2，CHEN Xiao-qian1，WANG Tian-yang1，CHEN Jing-feng1，PAN Xiao-dong1，WU Cun-zao1，XIA Peng1，CHEN Bi-cheng1，YANG Yi-rong1
(1Transplantation Centre，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;2Department of Urology，People’s Hospital of Lishui City，Lishui 323000，China.E-mail:chenbicheng@hotmail.com)

AIM:To investigate the association of killer cell immunoglobulin-like receptor(KIR)genotype and cytomegalovirus(CMV)-BK virus(BKV)reactivation/infection in the first year after renal transplantation.METHODS:KIR genotypes were analyzed by PCR with sequence-specific primers(PCR-SSP)in 48 renal transplant recipients and KIR genotypes were grouped into AA if they contained only the canonical group A haplotype genes.The genotype containing additional KIR genes was referred to BX，as it contained at least 1 group B haplotype.Real-time quantitative PCR for CMVBKV DNA was performed to test the viral load.The association of KIR genotype and CMV-BKV infection and the effect of KIR genotype on renal function were analyzed.RESULTS:No obvious difference in the concentration of immunosuppressant and the occurrence of CMV infection/reactivation in the first year after renal transportation was observed between KIRAA and KIR-BX genotype groups.However，there was a significantly negative correlation between KIR-BX genotype and the cumulative incidence of BKV infection/reactivation.The average concentration of serum creatinine over 1～12 months after operation in KIR-AA genotype group was lower than that in KIR-BX genotype group.The levels of blood urea nitrogen and uric acid showed no obvious difference between the 2 groups.CONCLUSION:There is a significantly negative correlation between KIR-BX genotype and the cumulative incidence of BKV infection/reactivation，but not CMV infection/reactivation in the first year after renal transplantation.

Killer cell immunoglobulin-like receptor;Genetic polymorphism;Renal transplantation;Cyto-megalovirus;BK virus

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.019

1000-4718(2014)02-0302-06

2013-10-15

2013-12-30

溫州市科技計劃(No.H20110019;No.H20100070);浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No.Y2110944;No.LY12H1004);浙江省教育廳重中之重學(xué)科外科學(xué)基金資助項目

△通訊作者Tel:0577-55579220;E-mail:chenbicheng@hotmail.com