MicroRNA-196a通過HOXB7調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖功能*

黎佼，董珺，張振輝，田朝偉，成傳訪，吳功雄，劉世明△

(1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，2廣州心血管疾病研究所，廣東廣州 510260)

MicroRNA-196a通過HOXB7調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖功能*

黎佼1，2，董珺1，張振輝1，田朝偉1，成傳訪1，2，吳功雄2，劉世明1，2△

(1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，2廣州心血管疾病研究所，廣東廣州 510260)

目的:研究年齡相關microRNA-196a(miR-196a)對人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)增殖功能的調(diào)控作用。方法：通過MTT研究年齡對hMSCs增殖能力的影響。通過microRNA芯片和qRT-PCR檢測年齡對miR-196a表達的影響。通過轉(zhuǎn)染miR-196a模擬物或抑制物，研究其對hMSCs增殖能力的影響。通過螢光素酶報告基因系統(tǒng)證實HOXB7為miR-196a的靶基因。通過siRNA研究HOXB7對堿性成纖維細胞生f長因子(bFGF)表達及hMSCs增殖功能的影響和研究bFGF對hMSCs增殖功能的影響。結果:隨年齡增加，hMSCs的增殖能力下降，miR-196a的表達增加。miR-196a可抑制hMSCs的增殖。抑制miR-196a的表達可促進hMSCs的增殖。同時抑制miR-196a和HOXB7的表達，使miR-196a失去對hMSCs增殖能力的調(diào)控作用。抑制HOXB7的表達可使bFGF的表達下調(diào)。直接抑制HOXB7或bFGF的表達可抑制hMSCs的增殖。結論:miR-196a通過抑制HOXB7及bFGF的表達導致hMSCs增殖能力下降。

人骨髓間充質(zhì)干細胞;MicroRNA-196a;年齡;HOXB7蛋白

人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)具有增殖、分化及自我更新的能力。然而年齡能夠影響hMSCs的功能，例如:隨年齡增加，細胞增殖、分化能力下降，衰老增加［1］。已有研究證實microRNA參與調(diào)控細胞生存、復制、衰老、增殖及分化等過程［2-3］。并且隨年齡的增加，microRNA的表達也發(fā)生改變。其中老年小鼠的肝臟、肺臟和腦組織的microRNA隨年齡增加而表達發(fā)生改變;不同年齡段來源的人外周血單核細胞的microRNA表達也發(fā)生改變［2］。我們的前期研究同樣證實老年C57/BL6小鼠來源的MSCs以及老年人來源的hMSCs的增殖、分化能力隨年齡的增加而下降［4］。并且在hMSCs中，microRNA的表達隨年齡的增加也發(fā)生改變，其中miR-196a表達上調(diào)最為明顯［5］。關于miR-196a在hMSCs中的作用研究甚少，Kim等［6］證實miR-196a在促進人脂肪組織來源間充質(zhì)干細胞(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，hASCs)向成骨細胞分化過程中可能同時抑制了其增殖?；趍iR-196a可能參與調(diào)控hMSCs增殖功能的假設，本研究觀察了miR-196a對不同年齡段hMSCs增殖能力的調(diào)控作用，并進一步探討其機制。

材料和方法

1 材料

1.1 人骨髓的提取通過廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準，與患者簽訂知情同意書。在廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心外科瓣膜病患者手術過程中吸取人骨髓5 mL。供體為17～30歲者定義為年青組，65～80歲者定義為年老組。年青組與年老組患者均給與相同藥物治療，排除腫瘤、乙肝、HIV感染等因素。

1.2 主要試劑及儀器胎牛血清和Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco);Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen);抗CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD166流式抗體(Multi-Sciences Biotech);CellTiter 96細胞增殖試劑盒(Promega);SYBR Green熒光定量試劑盒和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo);淋巴細胞分離液(Ficoll);熒光定量PCR儀(ABI7300);多功能酶標儀(Tecan);RNA/ DNA微量分光光度計(NanoVue)。

2 方法

2.1 hMSCs的提取及鑒定將人骨髓小心疊加于等體積的淋巴細胞分離液上層，4℃下以2 000 r/ min離心20 min，吸取分離液和血漿界面云霧狀的單個核細胞層，用無血清IMDM懸浮后，以1 000 r/min離心。按2×105/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。48 h后換液，將不貼壁的細胞洗去。貼壁細胞每3 d換液，待細胞融合度達80%以上時，胰酶消化傳代。流式細胞術檢測細胞表面CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD166的表達。

2.2 hMSCs增殖能力檢測用Promega細胞增殖檢測試劑盒檢測hMSCs增殖能力。hMSCs以3 000 cells/well培養(yǎng)于96孔板中。每100 μL培養(yǎng)基中加入20 μL試劑盒中MTS及PMS混合液，4 h后通過酶標儀在波長490 nm處檢測吸光度，并繪制細胞增殖曲線。

2.3 MicroRNA基因芯片檢測及qRT-PCR檢測分別選取年青組(17歲、20歲、25歲)及年老組(78歲、80歲、75歲)的hMSCs送于北京博奧生物有限公司進行microRNA基因芯片檢測。用1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過qRT-PCR檢測miR-196a、同源框B7(homeobox B7，HOXB7)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growht factor，bFGF)的表達。分別選取U6及GAPDH作為內(nèi)參照。各基因引物見表1。

2.4 雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)構建通過pGL4.13螢光素酶質(zhì)粒構建pGL4.13-HOXB7-3’UTR報告基因載體，并通過重疊延伸PCR刪除miR-196a與HOXB7 3’UTR直接結合位點，構建pGL4.13-HOXB7-3’UTR-mut。擴增所用引物見表1。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers

2.5 細胞轉(zhuǎn)染miR-196a模擬物、抑制物、si-HOXB7、si-bFGF及其相應的陰性對照均由上海吉瑪公司合成，序列見表2。hMSCs培養(yǎng)于24孔板，無血清培養(yǎng)過夜后，更換為新鮮無血清及抗生素培養(yǎng)基(500 μL/well)。將小分子RNA稀釋于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，加入1 μL Lipofectamine RNAiMAX，輕柔混勻后室溫放置15 min;將RNAiMAX與microRNA/siRNA的稀釋液加入24孔板的各孔細胞中，培養(yǎng)48 h按實驗需要處理細胞。

表2 MicroRNA與siRNA序列Table 2.The sequences of microRNA and siRNA

雙螢光素酶報告系統(tǒng)實驗:細胞于48孔板培養(yǎng)24 h后，更換為無血清和抗生素DMEM培養(yǎng)基(200 μL/well)。將小分子RNA和表達質(zhì)粒稀釋于25 μL Opti-MEM中，輕柔混勻;將1 μL Lipofectamine 2000稀釋于25 μL Opti-MEM中混勻，室溫放置5 min;將上述兩液混合，室溫放置20 min后加入各孔細胞中。培養(yǎng)6 h后更換成含10%血清的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)42 h后按實驗需要處理細胞。

miR-196a模擬物及陰性對照的終濃度為100 nmol/L;miR-196a抑制物及陰性對照的終濃度為200 nmol/L;siRNA及其對照的終濃度為20 nmol/L。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，兩組間的差異顯著性采用獨立樣本t檢驗，多組間的差異顯著性采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。

結果

1年齡影響了hMSCs增殖能力和microRNA的表達

通過流式細胞術檢測年青和年老hMSCs表面特異性抗原的表達，發(fā)現(xiàn)年齡對hMSCs表面特異性抗原的表達并無影響。年青和年老hMSCs均表達間充質(zhì)干細胞表面特異性抗原CD44(87.20%±9.30% vs 89.73%±6.82%)、CD29(95.32%±3.31%vs 96.30%±2.52%)和CD166(80.42%±12.67%vs 79.28%±8.27%)，而不表達造血干細胞表面特異性抗原CD34(0.013%±0.006%vs 0.016%± 0.012%)、CD31(0.020%±0.013%vs 0.018%± 0.009%)和CD45(0.010%±0.014%vs 0.015%± 0.010%)。但隨年齡增加，hMSCs增殖能力下降，見圖1A。年齡也影響了microRNA的表達，通過Affymetrix GeneChip 2.0 microRNA芯片分析我們發(fā)現(xiàn)miR-196a的表達隨年齡增加而上調(diào)，見圖1B。通過qRT-PCR檢測，我們進一步證實，與年青組相比，年老組hMSCs中miR-196a表達上調(diào)6.51倍，見圖1C。

Figure 1.Alternation of proliferation and miR-196a expression in young(Y)and old(O)hMSCs.A:five-day growth curves of the hMSCs;B:miR-196a expression in the hMSCs was determined by microarray analysis;C:miR-196a expression in the hMSCs was determined by qRT-PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs O.圖1年齡對hMSCs增殖能力及miR-196a表達的影響

2 miR-196a抑制了hMSCs的增殖能力

通過轉(zhuǎn)染miR-196a抑制物，與陰性對照組相比，年青組和年老組的miR-196a分別下調(diào)了0.70倍及0.61倍。相反，通過轉(zhuǎn)染miR-196a模擬物，與陰性對照組相比，年青組和年老組的miR-196a分別上調(diào)了5.0倍及6.5倍，見圖2A。抑制miR-196a表達后，我們發(fā)現(xiàn)年青組及年老組的hMSCs增殖能力上升;相反，過表達miR-196a后，年青組及年老組的hMSCs增殖能力下降，見圖2B、C。

Figure 2.Effect of miR-196a on young(Y)and old(O)hMSC proliferation.A:down-regulated miR-196a expression in hMSCs by miR-196a inhibitor(Inh196a)and up-regulated miR-196a expression in hMSCs by miR-196a mimic(196a);B:five-day growth curves of Inh196a-transfected hMSCs;C:five-day growth curves of 196a-transfected hMSCs.c1:miR-196a inhibitor scrambled control;c2:miR-196 mimic scrambled control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Y-c1;△P＜0.05 vs Y-c2;#P＜0.05 vs O-c1;▲P＜0.05 vs O-c2.圖2 miR-196a對hMSCs增殖功能的影響

3 miR-196a直接調(diào)控HOXB7的表達

通過TargetScan網(wǎng)站預測，我們發(fā)現(xiàn)miR-196a可與HOXB7 3’UTR相結合，直接調(diào)節(jié)HOXB7的表達，見圖3A。我們將hMSCs同時轉(zhuǎn)染miR-196a的模擬物和HOXB7的報告基因載體(野生型HOXB7和突變型HOXB7-mut)，結果顯示，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染野生型載體的細胞螢光素酶活性下降至0.66倍，而轉(zhuǎn)染突變型載體未見變化，見圖3B。hMSCs先轉(zhuǎn)染miR-196a的抑制物，抑制內(nèi)源性miR-196a表達，再轉(zhuǎn)染HOXB7的報告基因載體(野生型HOXB7和突變型HOXB7-mut)，結果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型載體的細胞螢光素酶活性升高至1.40倍，而轉(zhuǎn)染突變型載體未見變化，見圖3C。

Figure 3.miR-196a targeted the 3’UTR of HOXB7 mRNA.A:miR-196a sequences and the binding sites in HXB7 3’UTR;B: hMSCs were cotransfected with miR-196a mimic(196a)or scrambled control(SC)and pGL4.13-HOXB7-3’UTR or pGL4.13-HOXB7-3’UTR-mut;C:hMSCs were cotransfected with miR-196a inhibitor(Inh196a)or inhibitor SC(InhSC) and pGL4.13-HOXB7-3’UTR or pGL4.13-HOXB7-3’UTR-mut.The luciferase activity for HOXB7 3’UTR was measured 48 h after transfection and normalized to endogenous Renilla luciferase.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs 196a+HOXB7-mut;#P＜0.05 vs Inh196a+HOXB7-mut.圖3 miR-196a直接調(diào)控HOXB7的表達

4 miR-196a通過HOXB7抑制hMSCs增殖

通過qRT-PCR檢測我們發(fā)現(xiàn)，HOXB7的表達與miR-196a剛好相反，隨年齡的增加而下調(diào)，年老組為年青組的0.31倍，見圖4A。通過轉(zhuǎn)染miR-196a模擬物過表達miR-196a，我們發(fā)現(xiàn)年青及年老的hMSCs中HOXB7 mRNA和蛋白表達相應下調(diào)，mRNA表達量分別為對照組的0.47倍及0.38倍，見圖4B、C。通過轉(zhuǎn)染miR-196a抑制物抑制miR-196a的表達，我們發(fā)現(xiàn)年青及年老的hMSCs中HOXB7的表達相應上調(diào)，分別為對照組的2.55倍及3.37倍，見圖4C。為了進一步證實miR-196a通過HOXB7抑制hMSCs增殖，我們構建了siRNA抑制HOXB7的表達，qRT-PCR的實驗結果顯示，siRNA可以抑制年青及年老的hMSCs中HOXB7的表達，分別為對照組的0.23倍及0.31倍，見圖4C。直接抑制HXOB7表達后，我們同樣發(fā)現(xiàn)年青及年老hMSCs的增殖能力下降，見圖4D。我們通過siRNA抑制HOXB7的表達對抗miR-196a抑制物對HOXB7表達的上調(diào)作用后檢測年青及年老hMSCs的增殖能力，發(fā)現(xiàn)抑制HOXB7的表達后miR-196a抑制物喪失了促進年青及年老hMSCs增殖的能力，見圖4C、E。

Figure 4.Effect of HOXB7 on young(Y)and old(O)hMSC proliferation.A:HOXB7 mRNA expression in the hMSCs;B:HOXB7 protein expression in miR-196a mimic(196a)-transfected Y and O hMSCs;C:HOXB7 mRNA expression in the hMSCs transfected with 196a，miR-196a inhibitor(Inh196a)，si-HOXB7 or Inh196a+si-HOXB7;D:five-day growth curves of the hMSCs transfected with si-HOXB7;E:five-day growth curves of the hMSCs cotransfected with Inh196a and si-HOXB7.c1:miR-196a mimic scrambled control;c2:miR-196a inhibitor scrambled control;c3:si-HOXB7 control;c4:miR-196a inhibitor scrambled control and si-HOXB7 control.Mean±SD.n=3.☆P＜0.05 vs O;▲P＜0.05 vs c1;△P＜0.05 vs c2;*P＜0.05 vs Y-c3;#P＜0.05 O-c3.圖4 HOXB7對hMSCs增殖的影響

5 HOXB7調(diào)控bFGF的表達

qRT-PCR的結果顯示，bFGF的表達與HOXB7類似，隨年齡的增加而下調(diào)，年老組為年青組的0.36倍，見圖5A。通過轉(zhuǎn)染miR-196a模擬物過表達miR-196a，我們發(fā)現(xiàn)年青及年老的hMSCs中bFGF的表達相應下調(diào)，分別為對照組的0.59倍及0.33倍;通過轉(zhuǎn)染miR-196a抑制物抑制miR-196a的表達，我們發(fā)現(xiàn)年青及年老的hMSCs中bFGF的表達相應上調(diào)，分別上調(diào)至2.04倍及3.34倍;通過siRNA抑制HOXB7表達，我們發(fā)現(xiàn)年青及年老hMSCs中bFGF的表達相應的下調(diào)，分別為對照組的0.35倍及0.26 倍;同時抑制HOXB7及miR-196a表達時，我們發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組中bFGF的表達無顯著差異，見圖5B。我們同樣構建了siRNA直接抑制bFGF的表達，通過qRT-PCR我們發(fā)現(xiàn)siRNA可以抑制年青及年老hMSCs中bFGF的表達，分別為對照組的0.30倍及0.13倍;直接抑制bFGF表達后，我們同樣發(fā)現(xiàn)年青及年老hMSCs的增殖能力下降，見圖5B、C。

上述結果表明，年齡的增長導致hMSCs中miR-196a的表達增加，從而抑制了其靶基因HOXB7的表達;HOXB7表達下調(diào)，使其調(diào)控的bFGF表達也同樣下降，兩者的共同作用使年青及年老hMSCs增殖能力下降，見圖5D。

討論

目前為止，很多研究發(fā)現(xiàn)microRNAs與年齡增加引起的功能改變及導致的疾病有關，但是microRNAs在此過程中的所起的作用及其機制了解甚少。本課題組的前期研究通過microRNAs芯片技術，比較了年青和年老的hMSCs中900多個microRNAs的表達，并通過qRT-PCR證實hMSCs中miR-196a、miR-378、miR-486-5p和miR-664-star的表達隨年齡的增加而上調(diào);而miR-10a、miR-708和miR-3197的表達隨年齡的增加而下調(diào)［5］。其中miR-196a隨年齡的增加表達上調(diào)最明顯。本研究進一步探討了miR-196a對hMSCs功能的調(diào)控作用及其機制。

MicroRNAs可參與調(diào)控干細胞的增殖功能。Liu等［7］的研究發(fā)現(xiàn)miR-17-92簇調(diào)控腦卒中后神經(jīng)祖細胞的增殖及存活。在缺血神經(jīng)祖細胞或者缺血動物的室下區(qū)過表達miR-17-92簇均可促進細胞增殖，相反抑制其表達則抑制細胞增殖，增加細胞死亡。同樣，也有研究證實miR-210可通過抑制鐵硫簇支架同系物(iron-sulfur cluster scaffold homolog 2，ISCU2)及蛋白酪氨酸磷酸酶非受體2型(protein tyrosine phosphatase，non-receptor type 2，PTPN2)的表達促進hASCs的增殖及遷移［8］。Wang等［9］的研究也證實miR-16抑制了蛻膜來源間充質(zhì)干細胞的增殖及遷移，并且通過調(diào)控周期素E1使細胞周期停滯。

在與增殖功能相關microRNAs的研究中，miR-196a被證實參與調(diào)控多種細胞的增殖。我們的研究證實，miR-196a的表達上調(diào)是年齡導致hMSCs增殖能力下降的主要因素。這與Kim等［6］在hASCs中的研究類似，他們證實miR-196a通過調(diào)控HOXC8的表達抑制了hASCs的增殖。在非小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-196a在癌組織及肺癌細胞株中高表達，miR-196a通過抑制HOXA5的表達促進腫瘤細胞增殖和侵襲［10］。Sun等［11］在胃癌中也發(fā)現(xiàn)miR-196a的表達上調(diào)。腫瘤體積越大，臨床分期越高，miR-196a表達越高。而相應的，miR-196a表達越高，胃癌病人生存時間越短。在胃癌細胞株SGC7901中抑制miR-196a表達可以抑制細胞周期的進展，抑制細胞增殖及細胞集落單位的形成。細胞類型及調(diào)控機制的不同可能是導致miR-196a功能差異的主要原因。

一個microRNA可能調(diào)控多個靶基因，多個microRNA也可能只調(diào)控一個靶基因。研究證實miR-196a的靶基因可能有:HOXB8、HOXC8、HOXD8、 HOXA7、HOXB7、ERG、HMGA2、ANXA1、S100A9、SPRR2C、KRTS等。我們的研究證實在hMSCs中HOXB7為miR-196a的靶基因，miR-196a可以直接抑制HOXB7 mRNA和蛋白的表達。這與Kim等［6］在hASCs中的研究結果，以及Braig等［12］在黑色素瘤中的研究結果類似。HOXB7被證實可促進多種細胞的增殖:在造血干細胞的研究中，Care等［13］發(fā)現(xiàn)HOXB7可以促進造血干細胞的增殖和分化;Liao等［14］的研究發(fā)現(xiàn)在結直腸癌細胞株中過表達HOXB7可以促進細胞增殖和腫瘤形成，HOXB7在結直腸癌進展中起重要作用;在口腔癌中的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結果:口腔癌的發(fā)病可能是由HXOB7促進細胞增殖而導致的，HXOB7可能是口腔鱗癌重要的預后指標［15］。此外，Naora等［16］的研究發(fā)現(xiàn)在正常卵巢表面上皮細胞中過表達HOXB7可以促進細胞增殖，更重要的是，此研究進一步證實HOXB7可以結合并反式激活bFGF啟動子，促進細胞蓄積和釋放bFGF。在乳腺癌細胞中的研究也同樣發(fā)現(xiàn)，HOXB7的表達促進了bFGF的表達［17］。與HOXB7類似，bFGF同樣也可以促進多種干細胞增殖，例如bFGF可以減少細胞群體倍增時間，促進臍帶來源干細胞的增殖，而不影響其免疫表型的表達及免疫功能［18］;bFGF可以促進滑膜干細胞的增殖并促進其向成骨細胞分化［19］。這與我們的研究結果是一致的:隨年齡的增加hMSCs中HOXB7和bFGF的表達下調(diào)，細胞增殖能力下降。通過siRNA直接抑制HOXB7或者bFGF的表達可以抑制hMSCs增殖。HXOB7與bFGF表達下調(diào)是miR-196a導致hMSCs增殖能力下降的主要原因。

綜上所述，miR-196a通過抑制HOXB7及bFGF的表達導致hMSCs增殖能力下降。本課題闡述了miR-196a導致hMSCs增殖能力下降的機制，為年齡相關microRNAs——miR-196a的運用提供了理論基礎，為microRNAs及hMSCs在再生醫(yī)學中的運用提供了新的研究方向。

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MicroRNA-196a modulates proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells through HOXB7

LI Jiao1，2，DONG Jun1，ZHANG Zhen-hui1，TIAN Chao-wei1，CHENG Chuan-fang1，2，WU Gong-xiong2，LIU Shi-ming1，2
(1Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital，2Guangzhou Institute of Cardiovascular Diseases，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China.E-mail:gzliushiming@126.com)

AIM:To investigate the effects of microRNA-196a(miR-196a)on the proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells(hMSCs).METHODS:Cell growth was evaluated by MTT assay.The expression of miR-196a was determined by microRNA array and quantitative real-time PCR(qRT-PCR).The effect of miR-196a on hMSC proliferation was detected by transfection of miR-196a mimic or inhibitor.Using dual-luciferase reporter system，the target gene of miR-196a was identified.The effect of HOXB7 on basic fibroblast growth factor(bFGF)expression and hMSC proliferation was detected by siRNA.The effect of bFGF on hMSC proliferation was analyzed by siRNA.RESULTS:The proliferation ability was decreased and the expression of miR-196a was up-regulated in the old hMSCs compared with the young hMSCs.Up-regulation of miR-196a resulted in increased proliferation of hMSCs.Conversely，down-regulation of miR-196a resulted in decreased cell proliferation.Homeobox B7(HOXB7)was the target gene of miR-196a.The regulation of miR-196a on hMSC proliferation was attenuated by inhibiting the expression of miR-196a and HOXB7 together.Down-regulation of miR-196a inhibited the expression of bFGF.Direct repression of HOXB7 or bFGF expression inhibited the hMSC proliferation.CONCLUSION:miR-196a inhibits the proliferation of hMSCs by repressing the expression of HOXB7 and bFGF.

Human bone marrow mesenchymal stem cells;MicroRNA-196a;Age;HOXB7 protein

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.015

1000-4718(2014)02-0278-08

2013-09-25

2013-12-11

廣州市科信局重大民生攻關專項(No.2012Y2-00027);廣州市屬高?？蒲杏媱濏椖?No.2012C232);廣州醫(yī)科大學博士科研項目(No.2012C42)

△通訊作者Tel:020-34153522;E-mail:gzliushiming@126.com