沉默JAG1基因?qū)θ巳橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

袁磊，李伯和，時冉冉，高麗，宋金玲，王建國

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校分子生物學(xué)實驗室，河南漯河 462002)

沉默JAG1基因?qū)θ巳橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

袁磊，李伯和，時冉冉，高麗，宋金玲，王建國△

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校分子生物學(xué)實驗室，河南漯河 462002)

目的:探究沉默Jagged 1(JAG1)基因?qū)θ巳橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制。方法：用已構(gòu)建的pRS-JAG1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，采用Western blotting方法檢測重組質(zhì)粒對JAG1蛋白表達(dá)的影響;MTT比色法測定沉默JAG1對細(xì)胞生長的抑制情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡;蛋白印記分析細(xì)胞周期蛋白1(cyclin D1)、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p-Rb、Bcl-2、Bax、Bcl-xL和cleaved caspase-3蛋白水平的變化。結(jié)果:Western blotting結(jié)果證實重組質(zhì)粒可在72h內(nèi)有效抑制JAG1蛋白表達(dá);人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞JAG1被沉默后，細(xì)胞的生長速度明顯減慢，細(xì)胞明顯阻滯于G0/G1期，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，cyclin D1、p-Rb、Bcl-2和Bcl-xL蛋白水平被下調(diào)(P＜0.05)，而p21CIP1/WAF1、p27KIP1、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高(P＜0.05)。結(jié)論:沉默JAG1可有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究為以JAG1為分子靶點的三陰乳腺癌治療提供實驗依據(jù)。

JAG1蛋白;短發(fā)夾RNA;細(xì)胞周期;細(xì)胞凋亡;MDA-MB-231細(xì)胞

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來發(fā)病率和死亡率明顯上升，并趨于年輕化。盡管手術(shù)治療和術(shù)后多種輔助治療對患者的預(yù)后有明顯的改善，但是乳腺癌仍具有較高的復(fù)發(fā)率和死亡率［1］。Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，在進(jìn)化上高度保守，通過相鄰細(xì)胞之間的相互作用調(diào)控胚胎發(fā)育、血管發(fā)生、程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞增殖等多種生理過程［2-5］，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、增殖和血管生成等病理過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用［6-7］。

Notch信號途徑的激活始于Notch受體胞外區(qū)與相鄰細(xì)胞表面的Notch配體胞外區(qū)的結(jié)合，哺乳動物有4種Notch受體(Notch1～4)和5種Notch配體(Delta-like ligand，DLL1，3，4和Jagged，JAG1，2)。在乳腺癌細(xì)胞系中，MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468、ZR-75-1、T47D和SKBR3等細(xì)胞均不表達(dá)DLL3、DLL4和Notch4，只有MDA-MB-231細(xì)胞不表達(dá)Notch3，MDA-MB-468和SKBR3細(xì)胞不表達(dá)JAG2，MCF-7、ZR-75-1和T47D細(xì)胞表達(dá)DLL1，JAG1在MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)［8］。

O＇Neill等［9］的研究發(fā)現(xiàn)Notch2信號通路可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)沉默Notch1基因可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡［10］。為進(jìn)一步探討Notch配體在細(xì)胞增殖和凋亡中的作用及其作為分子靶點用于乳腺癌治療的潛在價值，本研究通過沉默JAG1表達(dá)，在體外觀察其對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞由本實驗室保存;重組質(zhì)粒pRS-JAG1由本實驗室前期構(gòu)建;胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco;質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen;JAG1、cyclin D1、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p-Rb (Ser807/811)、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、β-actin抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Santa Cruz;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長情況，每2～3 d用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上時換為無血清培養(yǎng)基，使用Lipofectamine 2000將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pRS-JAG1和pRS-scrambled分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后用PBS洗去轉(zhuǎn)染試劑，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實驗分組:(1)control組:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRS-scrambled的MDA-MB-231細(xì)胞;(2)shJAG1組:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRS-JAG1的MDA-MB-231細(xì)胞。

2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)成密度為5×107/L的細(xì)胞懸液，每孔200 μL接種于96孔板，同時設(shè)空白對照孔。分別在1 d、2 d、3 d和4 d后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37℃培養(yǎng)4 h后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長吸光度A值。每組設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后，制備各實驗組細(xì)胞懸液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，取約5×105個細(xì)胞重懸于200 μL 1×binding buffer，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μL 1×binding buffer，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后，制備各實驗組細(xì)胞懸液，用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4℃固定24 h，離心去除乙醇，再用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1 mL PI溶液(50 mg/L)，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.6 Western blotting檢測蛋白水平重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后，裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用BCA法定量后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉液(5%BSA/TBST)封閉1 h，加入Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印記，運(yùn)用ImageJ軟件測定各蛋白條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 特異性shRNA抑制MDA-MB-231細(xì)胞JAG1蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRS-JAG1后的1～3 d，JAG1/β-actin灰度比分別為0.0820±0.0437、0.0517±0.0216和0.0323±0.0114，均顯著低于control組(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Expression of JAG1 protein in human breast cancer MDA-MB-231 cells after pRS-scrambled/pRS-JAG1 transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖1 pRS-scrambled/pRS-JAG1轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后JAG1蛋白表達(dá)

2 沉默JAG1抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長

用MTT法檢測1～3 d細(xì)胞的生長狀況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRS-JAG1的細(xì)胞生長減慢，第3天A值顯著低于control組(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Effect of JAG1 silencing on the growth of MDA-MB-231 cells detected by MTT assay.Mean±SD.n= 5.*P＜0.05 vs control group.圖2 MTT法檢測沉默JAG1對MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響

3 沉默JAG1對MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，shJAG1組G0/G1期細(xì)胞比例為(80.47%±2.02)%，顯著高于control組(P＜0.05)，S期和G2/M細(xì)胞比例分別為(8.51% ±1.15)%和(11.01%±0.88)%，均顯著低于control組(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Effect of JAG1 silencing on cell cycle of MDA-MB-231 cells detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默JAG1對MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響

4 沉默JAG1對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，shJAG1組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率為(17.45%±2.21)%，顯著高于control 組(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.Effect of JAG1 silencing on apoptosis of MDA-MB-231 cells detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默JAG1對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

5 沉默JAG1對cyclin D1、p21CIP1/WAF1、p27KIP1和p-Rb蛋白水平的影響

shJAG1組p21CIP1/WAF1/β-actin和p27KIP1/β-actin的灰度比分別為0.5396±0.0516和0.8092± 0.0762，均顯著高于control組(P＜0.05)，而cyclin D1/β-actin和p-Rb/β-actin的灰度比分別為0.2801 ±0.0309和0.4439±0.0472，均顯著低于control組(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Effects of JAG1 silencing on the protein levels of cyclin D1，p21CIP1/WAF1，p27KIP1and p-Rb in MDA-MB-231 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖5 沉默JAG1對cyclin D1、p21CIP1/WAF1、p27KIP1和p-Rb蛋白水平的影響

6 沉默JAG1對Bcl-2、Bax、Bcl-xL和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

shJAG1組Bcl-2/β-actin和Bcl-xL/β-actin的灰度比分別為0.3434±0.0325和0.4041±0.0527，均顯著低于control組(P＜0.05)，而Bax/β-actin和cleaved caspase-3/β-actin的灰度比分別為0.7790± 0.0623和0.7994±0.0887，均顯著高于control組(P＜0.05)，見圖6。

Figure 6.Effects of JAG1 silencing on phosphorylation of Bcl-2，Bax，Bcl-xL and cleaved caspase-3 in MDA-MB-231 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖6 沉默JAG1對Bcl-2、bax、Bcl-xL和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

討論

三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是以雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)、孕酮受體2(progesterone receptor 2，PR)和人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor，HER-2)均不表達(dá)為特點的乳腺癌細(xì)胞［11］，占所有乳腺癌細(xì)胞的10%～15%［12-14］，由于缺乏針對這些受體的有效治療靶點，無法采用內(nèi)分泌治療和曲妥單抗治療，導(dǎo)致預(yù)后較差［15］。于是化療就成為治療此類乳腺癌的主要方法，但存在療效不穩(wěn)定，副作用大以及多藥耐藥等問題，因此，急需找到針對TNBC的有效的分子治療靶點。

Notch信號通路與TNBC關(guān)系密切［16］，以Notch信號通路為靶向的γ分泌酶抑制劑(γ secretase inhibitors，GSI)將有可能改善TNBC患者的預(yù)后，但其所帶來的各種副作用會限制GSI的使用［17］。本研究選取人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞作為TNBC的代表，以Notch配體JAG1為靶點，采用shRAN干擾技術(shù)沉默JAG1，發(fā)現(xiàn)沉默JAG1可有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長。

細(xì)胞生長是細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，而細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞周期來完成的。細(xì)胞周期是多因子參與的高度精確和有組織的時序調(diào)控過程。細(xì)胞周期素、細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)和細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs)是細(xì)胞周期調(diào)控中的關(guān)鍵組分。細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)和細(xì)胞周期素E(cyclin E)屬細(xì)胞周期素家族成員，可分別與CDK4和CDK2結(jié)合并激活其活性，調(diào)控細(xì)胞由G1期至S期的轉(zhuǎn)變。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，Rb)是cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2激酶的一種重要底物。高度磷酸化的Rb與E2F轉(zhuǎn)錄因子解離，使E2F得以活化，從而激活一系列下游事件，其中包括DNA的復(fù)制，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。p27KIP1和p21CIP1/WAF1等是CDKIs中的重要成員，可與G1期激酶復(fù)合物如cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2等緊密結(jié)合，抑制這些激酶復(fù)合物對Rb的磷酸化，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。

本研究發(fā)現(xiàn)，沉默JAG1可顯著抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)，同時促進(jìn)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞p21CIP1/WAF1和p27KIP1蛋白表達(dá)，從而抑制Rb磷酸化，進(jìn)而阻止人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。

在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2家族成員起著至關(guān)重要的作用。Bcl-2家族可以分為兩大類，一類是抗凋亡的，主要有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等，另一類是促細(xì)胞死亡的，主要包括Bax、Bak、Bad、Bid等。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默JAG1可顯著下調(diào)人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)。Bax可插入線粒體外膜并寡聚成孔道，也可與線粒體外膜中的電壓依賴性陰離子通道(voltagedependent anion channel，VDAC)結(jié)合引起線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的持續(xù)開放，進(jìn)而引起線粒體外膜通透化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)和線粒體膜電位消散，釋放線粒體膜間腔中的促凋亡蛋白，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［18-19］。

綜上所訴，由于Notch1和Notch2在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)揮著相反的作用［9，20］，高表達(dá)的Notch配體JAG1可能通過與Notch1結(jié)合，促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。因此，JAG1-Notch1信號通路有望成為針對TNBC的有效的分子治療靶點。

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Effects of JAG1 gene silencing on proliferation and apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells

YUAN Lei，LI Bo-he，SHI Ran-ran，GAO Li，SONG Jin-ling，WANG Jian-guo
(Laboratory of Molecular Biology，Luohe Medical College，Luohe 462002，China.E-mail:wr0395@sina.com)

AIM:To investigate the effects of Jagged 1(JAG1)gene silencing on the proliferation and apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells.METHODS:The specific recombinant vector pRS-JAG1 was transfected into MDA-MB-231 cells with lipofectamine.The protein expression of JAG1 was observed by Western blotting after transfection.MTT assay was used to detect the effect of JAG1 gene silencing on the growth of the cells.The apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry.The protein levels of cyclin D1，p21CIP1/WAF1，p27KIP1，p-Rb，Bcl-2，Bax，Bcl-xL and cleaved caspase-3 were determined by Western blotting.RESULTS:Compared with control group，the expression level of JAG1 was reduced by pRS-JAG1 transfection for 72 h(P＜0.05).The growth of MDA-MB-231 cells in shJAG1 group was significantly inhibited(P＜0.05).The percentages of G0/G1-phase cells and early apoptotic rate were obviously higher in shJAG1 group than those in control group(P＜0.05).The shRNA-mediated JAG1 silencing decreased the protein levels of cyclin D1，p-Rb，Bcl-2 and Bax，and increased the protein levels of p21CIP1/WAF1，p27KIP1，Bax and cleaved caspase-3(P＜0.05).CONCLUSION:JAG1 silencing effectively inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human breast cancer cells，suggesting that JAG1 might serve as a therapeutic target for triple-negative breast cancer.

JAG1 protein;Short hairpin RNA;Cell cycle;Apoptosis;MDA-MB-231 cells

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.012

1000-4718(2014)02-0262-06

2013-10-31

2013-12-20

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(No.122300410277);漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？蒲谢鹳Y助項目(No.2010-S10)

△通訊作者Tel:0395-2112681;E-mail:wr0395@sina.com