ACSL3在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對前列腺癌轉(zhuǎn)移的影響*

李科，陳怡，董艷，葉志強(qiáng)

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1泌尿外科，4急診科，廣東廣州 510630;2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院乳腺外科，廣東廣州 510120;3暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系，廣東廣州 510632)

ACSL3在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對前列腺癌轉(zhuǎn)移的影響*

李科1，陳怡2，董艷3，葉志強(qiáng)4△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1泌尿外科，4急診科，廣東廣州 510630;2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院乳腺外科，廣東廣州 510120;3暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系，廣東廣州 510632)

目的:觀察比較長鏈脂酰輔酶A合成酶3(long-chain acyl-CoA synthetase 3，ACSL3)在前列腺正常上皮細(xì)胞和不同類型前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異，通過構(gòu)建ACSL3基因穩(wěn)定表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞株研究ACSL3對前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。方法：利用RT-PCR方法檢測ACSL3 mRNA在前列腺正常上皮細(xì)胞、局限性及轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系;以前列腺癌細(xì)胞基因組cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增ACSL3基因，重組構(gòu)建含有Flag標(biāo)簽的pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3質(zhì)粒，包裝慢病毒，轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞，通過熒光顯微鏡、RT-PCR和Western blotting等方法鑒定ACSL3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況;利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究ACSL3對前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的改變。結(jié)果:較前列腺正常上皮細(xì)胞，各種前列腺癌細(xì)胞中ACSL3 mRNA表達(dá)均明顯下降。同時，局限性前列腺癌細(xì)胞中ACLS3 mRNA表達(dá)較轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞明顯升高;此外，雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞比雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞中ACLS3 mRNA表達(dá)顯著降低。進(jìn)而，我們成功構(gòu)建和包裝了表達(dá)ACSL3基因的pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3重組質(zhì)粒及慢病毒，并轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)株;并且，通過Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)ACSL3表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:前列腺正常上皮細(xì)胞及不同前列腺癌細(xì)胞系中ACSL3的表達(dá)存在明顯差異，提示ACSL3可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用;成功構(gòu)建了ACSL3基因穩(wěn)定表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞株，并初步證實(shí)ACSL3過表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲力。

前列腺腫瘤;長鏈脂酰輔酶A合成酶3;腫瘤侵襲

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是歐美男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌［1］。近年來，隨著生活環(huán)境的改變、飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整和人口的老齡化比例上升等高危因素的增多，我國PCa發(fā)病率和死亡率逐年升高，且上升趨勢較快［2］。PCa發(fā)病及病程均較隱匿，研究發(fā)現(xiàn)PCa一旦進(jìn)展轉(zhuǎn)移，臨床根治的可能性就微乎其微，轉(zhuǎn)移已成為患者死亡的最主要原因［3］。目前，雄激素剝奪仍是PCa的主要治療方法之一;然而報道指出，去勢治療12～18個月后，因?yàn)樾奂に厥荏w(androgen receptor，AR)相關(guān)信號通路的作用，雄激素依賴性PCa(androgen-dependent prostate cancer，ADPC)可逐漸演化為雄激素非依賴性PCa(androgen-independent prostate cancer，AIPC)，從而導(dǎo)致患者最終死于雄激素不敏感細(xì)胞的廣泛轉(zhuǎn)移［4］。遺憾的是，現(xiàn)今臨床上無論是病理分期，還是Gleason評分等因素均無法有效地對PCa的轉(zhuǎn)歸進(jìn)行有效的評估。因此，尋找新穎可靠的PCa特異性標(biāo)志物以及治療干預(yù)靶點(diǎn)，對于準(zhǔn)確預(yù)測PCa的發(fā)生與進(jìn)展，深入研究HDPC向AIPC演變的機(jī)制，探索有效的治療措施，延長患者生存期和提高患者生活質(zhì)量有著重大意義。

近來，國外有研究利用蛋白組學(xué)技術(shù)和表達(dá)微陣列分析篩選PCa中AR信號通路的相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，發(fā)現(xiàn)長鏈脂酰輔酶A合成酶3(long-chain acyl-CoA synthetase 3，ACSL3)為AR信號通路調(diào)節(jié)的目標(biāo)基因之一，并在臨床PCa組織樣本中證實(shí)其轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，提示ACSL3可能與PCa的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)［5］。此外，另有文獻(xiàn)報道，ACSL3 與ETV1所組成的新型融合基因是導(dǎo)致ETV1在PCa中重排的重要因素，從而導(dǎo)致了PCa生物學(xué)行為的改變［6］。ACSL3作為長鏈脂酰輔酶A合成酶家族的成員之一，其主要生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)脂肪酸代謝，催化脂肪酸轉(zhuǎn)化成長鏈乙酰輔酶A，對于脂質(zhì)的合成、蛋白質(zhì)的修飾、β-氧化等過程都具有重要意義［7］;而脂肪酸代謝的異常與能量的獲得與傳遞緊密相連，是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。本研究檢測ACSL3在前列腺正常上皮細(xì)胞、局限性PCa細(xì)胞以及轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞中的表達(dá)差異，并比較ACSL3表達(dá)與PCa細(xì)胞的雄激素依賴性與否是否存在著關(guān)聯(lián);繼而，通過構(gòu)建ACSL3真核表達(dá)質(zhì)粒，并包裝慢病毒，轉(zhuǎn)移PCa細(xì)胞后篩選出ACSL3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究ACSL3在PCa發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用、分子機(jī)制及臨床意義奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、菌株實(shí)驗(yàn)所需前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-I、局限性PCa細(xì)胞株22Rv1(雄激素依賴性)、轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞株LNCaP(雄激素依賴性)和PC-3(雄激素非依賴性)均由武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。pCDNA3.1(+)-Flag質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存;pLenti-GFP-Neo載體購自GenScript;慢病毒載體系統(tǒng)購自Tronolab;大腸桿菌DH5α購自TaKaRa。

1.2 主要試劑Trizol Reagent、Lipofectamine LTX、Keratinocyte Serum-Free Medium和胎牛血清購自Invitrogen;EcoR I、Xho I、Ex Taq聚合酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit和PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)購自TaKaRa;凝膠DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小提試劑盒、PCR回收試劑盒以及去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒均購自O(shè)mega;Matrigel購自BD;Transwell板購自Corning;鼠源抗Flag標(biāo)簽單克隆抗體購自CST。

1.3 引物根據(jù)GenBank已發(fā)表的ACSL3基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR特異性引物，正義鏈5’-CAATTACAGAAGTGTGGGACT-3’，反義鏈5’-CACCTTCCTCCCAGTTCTTT-3’，由上海生工公司合成并檢測。根據(jù)GenBank已發(fā)表的ACSL3基因序列設(shè)計(jì)常規(guī)PCR特異性引物，正義鏈5’-CCGGAATTCGCCACCATGAATAACCACGTGTCTT-3’，反義鏈5’-CCGCTCGAGTTTTCTTCCATACATTCGCT-3’，在上游引物引入EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物引入Xho I酶切位點(diǎn)。引物均由上海生工公司合成并檢測。

2 方法

2.1 RT-PCR檢測ACSL3 mRNA在不同前列腺細(xì)胞中的表達(dá)水平前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-I、PCa細(xì)胞LNCaP、22Rv1和PC-3分別培養(yǎng)于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔時，Trizol抽提RNA，并以RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR程序?yàn)?37℃15 min;85℃5 s。然后以不同細(xì)胞的cDNA為模板，ACSL3特異性熒光定量引物進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，具體操作步驟參考PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)說明書，本實(shí)驗(yàn)采用相對定量PCR反應(yīng)，以GAPDH基因作為內(nèi)參照。

2.2 重組pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3質(zhì)粒的構(gòu)建以PC-3細(xì)胞基因組cDNA為模板擴(kuò)增得到上、下游分別加有EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的ACSL3基因序列，片段總長度為2 100 bp。按Gel Extraction Kit說明書進(jìn)行ACSL3基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物的回收，將ACSL3與pCDNA3.1(+)-Flag質(zhì)粒用EcoR I和Xho I雙酶切，分別回收純化，將兩者酶切純化的產(chǎn)物按照8∶1的摩爾比混合，用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver 2.0試劑盒連接1 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，然后涂布于含氨芐青霉素50 mg/L的LB固體培養(yǎng)基中。次日，隨機(jī)挑取10個單菌落，分別接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將菌落PCR篩選呈陽性的菌落用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA。將提取的質(zhì)粒DNA用EcoR I和Xho I雙酶切，進(jìn)行電泳檢測，以DS5000 marker為分子量參照，將篩選出的陽性克隆產(chǎn)物的菌液進(jìn)行測序鑒定，獲得pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3重組質(zhì)粒，-20℃凍存?zhèn)溆?。以同樣方法?gòu)建pLenti-GFP-Neo-ACSL3質(zhì)粒。

2.3 ACSL3慢病毒包裝構(gòu)建慢病毒載體系統(tǒng)為四質(zhì)粒系統(tǒng)，包括pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G以及Lenti-ACSL3。慢病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，細(xì)胞密度為0.5× 109/L時重新接種于25 mL的15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);pRsv-REV(10 μg)、pMDlg-pRRE(15 μg)、pMD2G(7.5 μg)和pLenti-GFP-Neo-ACSL3(20 μg)加入無菌水及CaCl2(2.5 mol/L)溶液中;當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時轉(zhuǎn)染，將DNA和磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)12 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液，加入胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h;收集轉(zhuǎn)染72 h的293T細(xì)胞上清液，離心后收集上清液，將病毒上清液以0.45 μm濾器過濾;把病毒粗提液樣品過濾離心，獲得病毒濃縮液，分裝后保存在病毒管中，-80℃長期保存。在進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測定后獲得Lenti-ACSL3慢病毒。

2.4 ACSL3穩(wěn)定表達(dá)PCa細(xì)胞株的構(gòu)建PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞長到80%～90%的匯合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染96 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察到熒光證實(shí)慢病毒轉(zhuǎn)染成功，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好，取轉(zhuǎn)染效率最高的PC-3細(xì)胞株加入含G418(500 mg/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，獲得穩(wěn)定表達(dá)ACSL3的雄激素非依賴性轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞PC-3ACSL3+。相同方法構(gòu)建雄激素依賴性轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞LNCaPACSL3+和雄激素依賴性局限性PCa細(xì)胞22Rv1ACSL3+。

2.5 RT-PCR及Western blotting檢測轉(zhuǎn)染PCa細(xì)胞中ACSL3的表達(dá)pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞24 h后，Trizol抽提RNA，并以RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，再以其為模板，ACSL3特異性熒光定量引物進(jìn)行RT-PCR定量檢測ACSL3 mRNA表達(dá)。pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞48 h后，加入100 μL含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，離心制備蛋白樣品，利用Western blotting檢測ACSL3蛋白表達(dá)。

2.6 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測ACSL3過表達(dá)對PCa細(xì)胞侵襲力的影響實(shí)驗(yàn)分為pCDNA3.1(+)-Flag空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組和pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組。Transwell每孔上室加入100 μL Matrigel，37℃培養(yǎng)箱孵育3 h。紫外照射滅菌過夜。下室中加入趨化液、細(xì)胞無血清培養(yǎng)上清后，鋪膠上室套入下室。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，分別加入對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液各200 μL，37℃培養(yǎng)箱孵育20 h。取出上室，吸去殘液和Matrigel膠。在上室中添加70%甲醇固定30 min，常規(guī)結(jié)晶紫染色，光鏡下觀察。隨機(jī)取3個高倍鏡視野，計(jì)數(shù)小室面細(xì)胞數(shù)即為穿透Matrigel細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)作為結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-I、PCa細(xì)胞LNCaP、22Rv1和PC-3的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，并以前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-I內(nèi)ACSL3 mRNA的表達(dá)水平為參考，比較分析PCa不同細(xì)胞與RWPE-I中ACSL3 mRNA的表達(dá)水平的差異。結(jié)果表明，較RWPE-I細(xì)胞，各種PCa細(xì)胞中ACSL3 mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。同時，局限性PCa細(xì)胞22Rv1中ACLS3 mRNA表達(dá)較轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞PC-3升高(P＜0.05)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)雄激素非依賴性PCa細(xì)胞PC-3比雄激素依賴性PCa細(xì)胞LNCaP及22Rv1中ACLS3 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。因此，我們認(rèn)為ACSL3的表達(dá)水平與PCa的發(fā)生、進(jìn)展轉(zhuǎn)移，以及與PCa細(xì)胞從雄激素依賴向雄激素非依賴演變具有一定的關(guān)聯(lián)性，見圖1。

Figure 1.ACSL3 mRNA expression in RWPE-I，LNCaP，22Rv1 and PC-3 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs RWPE-I;△P＜0.05 vs LNCaP;#P＜0.05 vs 22Rv1.圖1 前列腺正常上皮細(xì)胞及各種PCa細(xì)胞中ACSL3 mRNA的表達(dá)

2 pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以PC-3細(xì)胞基因組cDNA為模板擴(kuò)增ACSL3基因，1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物大小分別為2 100 bp左右，與預(yù)期ACSL3基因片段大小相符，見圖2A;重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定，得到1條2 100 bp的條帶，與預(yù)期ACSL3基因片段大小相符，見圖2B;菌落PCR鑒定為陽性的菌株重新?lián)u菌，抽提質(zhì)粒后經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，得到1條2 100 bp 和5.4 Kb的條帶，都與預(yù)計(jì)大小相符，見圖2C。以上結(jié)果初步證明成功構(gòu)建了pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3重組真核表達(dá)質(zhì)粒。

Figure 2.Construction and identification of eukaryotic expression plasmid pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3.A:ACSL3 gene amplified fragment;B:colony PCR of ACSL3 gene;C:ACSL3-plasmids digested by EcoRⅠand XhoⅠ;M:DS5000 marker.圖2 pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

3 RT-PCR及Western blotting鑒定ACSL3 mRNA和蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后，利用ACSL3特異性熒光定量引物進(jìn)行RT-PCR定量檢測mRNA表達(dá)，證實(shí)較對照組，ACSL3 mRNA水平明顯升高(P＜0.01)，見圖3A。同時，利用Flag標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測Flag-ACSL3蛋白表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組蛋白水平比對照組顯著增加(P＜0.01)，見圖3B。上述結(jié)果證明pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3重組真核表達(dá)質(zhì)粒在PCa細(xì)胞內(nèi)可以有效過表達(dá)ACSL3。

Figure 3.ACSL3 mRNA(A)and protein(B)expression in PC-3 cells after transfected with pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control.圖3 pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后的ACSL3 mRNA和蛋白表達(dá)

4 ACSL3穩(wěn)定表達(dá)PCa細(xì)胞株的構(gòu)建

PCa細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，慢病毒Lenti-ACSL3轉(zhuǎn)染細(xì)胞96 h后，取轉(zhuǎn)染效率最高的PC-3細(xì)胞株加入含G418(500 mg/L)的培基中培養(yǎng)3周，從而獲得ACSL3穩(wěn)定表達(dá)的雄激素非依賴性轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞PC-3ACSL3+、雄激素依賴性轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞LNCaPACSL3+和雄激素依賴性局限性PCa細(xì)胞22Rv1ACSL3+，見圖4。

5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對細(xì)胞遷移能力的影響

LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3質(zhì)粒24 h后，侵襲能力較pCDNA3.1(+)-Flag空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯下降，對照組和轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為45±8.85和23±7.62，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示ACSL3表達(dá)與PCa細(xì)胞的侵襲能力呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，見圖5。

Figure 4.Representative images of PCa cells which stably expressed ACSL3 gene(×60).A:PC-3ACSL3+;B:LNCaPACSL3+;C: 22Rv1ACSL3+.圖4 熒光倒置顯微鏡下觀察ACSL3穩(wěn)定表達(dá)的PCa細(xì)胞株

討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是腫瘤患者死亡的主要原因。盡管隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，認(rèn)識到腫瘤相關(guān)基因的過表達(dá)和沉默在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，但目前所發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的數(shù)量仍較少，且對其具體的調(diào)控機(jī)制依舊缺乏深入的研究，從而限制了相關(guān)基因在臨床診斷和治療中的應(yīng)用。因此，發(fā)現(xiàn)更多新的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，闡明其調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對研發(fā)新型診療方法，提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有決定性意義。

PCa作為最常見多發(fā)的男性惡性腫瘤之一，其早期癥狀并不明顯。雖然隨著臨床診斷技術(shù)的發(fā)展，PCa早期診斷率有所提高，但多數(shù)患者確診時常已處于較晚的進(jìn)展期［8］，而90%的進(jìn)展期PCa都已發(fā)生轉(zhuǎn)移［9］。同時，由于PCa生物學(xué)習(xí)性多變，其侵襲轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。每年因腫瘤轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡的比例占總死亡病例的70%。此外，常規(guī)的PCa去勢治療，在一段時間后PCa逐漸由激素依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)榧に胤且蕾囆裕沟弥委熥兊酶永щy，而這其中AR扮演著重要的角色;在ADPC向AIPC的轉(zhuǎn)變過程中，AR通路通過多種方式發(fā)揮作用，AR基因的擴(kuò)增、突變以及與共激活子之間作用的改變都可能使PCa細(xì)胞獲得激素非依賴型的生養(yǎng)能力，因此，闡明AR信號通路在PCa中的作用對PCa的診斷和治療有著重大意義［10］。

國外新近報道發(fā)現(xiàn)ACSL3是AR信號通路的相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，其作為長鏈脂酰輔酶A合成酶家族的成員，主要表達(dá)于前列腺、骨骼肌、睪丸、心臟和胎盤等組織中，在細(xì)胞內(nèi)的主要生理功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝，催化長鏈脂肪酸激活的第一步，在細(xì)胞內(nèi)可以作用于脂質(zhì)的合成或者蛋白質(zhì)修飾。細(xì)胞膜脂質(zhì)的組成和新陳代謝調(diào)節(jié)的改變與許多疾病有關(guān)，包括癌癥。研究表明長時間抑制ACSL3表達(dá)會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性［11］;在鼠的肝細(xì)胞中，通過RNA干擾抑制ACSL3基因的表達(dá)，導(dǎo)致很多與脂肪生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性的降低，如過氧化物酶體增殖激活受體γ、糖類反映元素結(jié)合蛋白、固醇調(diào)節(jié)元素結(jié)合蛋白1C、肝受體α和它們目標(biāo)基因的表達(dá)。另外，脂酰輔酶A合成酶的活性還可以改變AMPK活性，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)［12］。此外，細(xì)胞內(nèi)脂滴(lipid droplets，LDs)作為中性脂的儲存場所，在人肝細(xì)胞HuH7中ACSL3是LDs的主要連接蛋白、LDs包含各種各樣的蛋白、如PAT家族蛋白，小窩蛋白(caveolins)和Rab家族蛋白，而這些蛋白均為癌癥相關(guān)蛋白，表明ACSL3也可能與癌癥有關(guān)［13-15］。

本研究選擇ACSL3作為研究對象，初步證實(shí)了較前列腺正常上皮細(xì)胞，各種PCa細(xì)胞中ACSL3 mRNA表達(dá)明顯下降;而轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞中ACSL3的表達(dá)較局限性PCa細(xì)胞更低。與此同時，AIPC細(xì)胞中ACSL3表達(dá)比ADPC中也要顯著減少。由此我們推斷，ACSL3的表達(dá)水平可能與PCa的發(fā)生、進(jìn)展轉(zhuǎn)移，以及與PCa細(xì)胞從雄激素依賴向雄激素非依賴演變具有一定的關(guān)聯(lián)性;從而為PCa的早期診斷和預(yù)后評判提供了新的標(biāo)志物，同時為PCa的治療提供了潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。此外，本研究通過分子克隆方法，將目的片段ACSL3基因插入到含有Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pCDNA1.3(+)質(zhì)粒上，并包裝了慢病毒，然后對重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行了檢測，繼而構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)ACSL3的PCa細(xì)胞株，繼而通過Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)ACSL3表達(dá)與PCa細(xì)胞的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，這一切工作都為后續(xù)研究ACSL3在PCa的發(fā)生、進(jìn)展中的生物學(xué)功能，以及其在AR受體信號通路中的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Role of ACSL3 expression in suppressing prostate cancer cell metastasis

LI Ke1，CHEN Yi2，DONG Yan3，YE Zhi-qiang4
(1Department of Urology，4Department of Emergency，The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China;2Department of Breast Surgery，Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;3Department of Biotechnology，School of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:zqye@163.com)

AIM:To analyze the difference of long-chain acyl-CoA synthetase 3(ACSL3)expression between normal prostate epithelial cells and prostate cancer cells.METHODS:ACLS3 mRNA expression between normal prostate epithelial cells and prostate cancer cells was compared using RT-PCR.Meanwhile，ACSL3 gene was amplified from prostate cancer cells，and the eukaryotic expression plasmid pCDNA3.1(+)-Flag-ACLS3 and lentivirus Lenti-ACLS3 were constructed.After transfection of ACSL3-plasmid and lentivirus into the prostate cancer cells，ACSL3 expressive was detected by RT-PCR and Western blotting，and then Matrigel invasion assay was performed to investigate the alteration of the invasive ability of the prostate cancer cells with over-expression of ACSL3.RESULTS:A significant difference of ACSL3 mRNA level between normal prostate epithelial cells and prostate cancer cells was observed.ACSL3 was highly expressed in localized prostate cancer cells compared to metastatic prostate cancer cells，while ACSL3 expression was higher in androgendependent prostate cancer cells than that in androgen-independent prostate cancer cells.Furthermore，the eukaryotic expression plasmid and lentivirus containing ACLS3 gene were successfully constructed.The prostate cancer cell line whichstably over-expressed ACLS3 was established.Up-regulation of ACSL3 inhibited the invasive ability of prostate cancer cells.CONCLUSION:ACSL3 plays an antagonistic role in invasiveness of prostate cancer.

Prostate neoplasms;Long-chain acyl-CoA synthetase 3;Neoplasm invasiveness

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.010

1000-4718(2014)02-0250-06

2013-09-29

2013-11-04

廣東省科技計(jì)劃(No.2011B061300011)

△通訊作者Tel:020-85253010;E-mail:zqye@163.com