七葉皂苷鈉通過抑制Akt和ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡及對(duì)死亡受體表達(dá)的影響*

齊世美，戚之琳，凌烈鋒，呂俊，章堯

(皖南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，安徽蕪湖 241002)

七葉皂苷鈉通過抑制Akt和ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡及對(duì)死亡受體表達(dá)的影響*

齊世美，戚之琳，凌烈鋒，呂俊，章堯△

(皖南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，安徽蕪湖 241002)

目的:探討七葉皂苷鈉誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的作用及其分子機(jī)制。方法：采用MTT法檢測(cè)七葉皂苷鈉對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖抑制作用;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變;利用annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;采用DAPI單染法熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核變化情況;利用Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白［聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、pro-caspase-3］和細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào)通路(Akt、ERK)以及TRAIL受體(DR4、DR5)的變化情況。結(jié)果:七葉皂苷鈉以劑量依賴的方式顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖;七葉皂苷鈉作用于HeLa細(xì)胞后，可見典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞凋亡率顯著增加;隨著七葉皂苷鈉濃度升高，cleaved PARP、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9明顯增多，pro-caspase-3顯著減少，p-Akt和p-ERK激活減少，細(xì)胞內(nèi)DR4和DR5總蛋白水平上調(diào)。結(jié)論:七葉皂苷鈉通過抑制細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào)通路，上調(diào)死亡受體水平，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

七葉皂苷鈉;宮頸腫瘤;細(xì)胞凋亡;死亡受體;Akt通路;ERK通路

七葉皂苷鈉(sodium aescinate，SA)是從七葉樹科植物天師栗的干燥成熟果實(shí)娑羅子中提取得到的三萜皂苷鈉鹽，臨床主要用于治療腦水腫以及創(chuàng)傷引起的肢體炎癥腫脹。近年來的研究顯示，七葉皂苷具有顯著的抗炎［1］、提高缺血腦組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性［2］、抑制血管新生［3-5］、抑制胰脂肪酶活性［6］等作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，七葉皂苷可以抑制人類慢性髓細(xì)胞樣白血病K562細(xì)胞［7］和急性T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞［8］的增殖，另外能夠明顯增強(qiáng)5-氟尿嘧啶等抗腫瘤藥物的殺傷作用［9］。但是關(guān)于七葉皂苷鈉對(duì)宮頸癌的抗腫瘤效果還未見文獻(xiàn)報(bào)道，它發(fā)揮抗腫瘤作用的具體分子機(jī)制和生物標(biāo)靶尚未闡明。本研究以宮頸癌HeLa細(xì)胞株為研究模型，探討七葉皂苷鈉對(duì)死亡受體水平的調(diào)控作用，檢測(cè)它對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡信號(hào)通路的影響，試圖闡明其發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，為制定七葉皂苷鈉的臨床治療方案和拓展七葉皂苷鈉的臨床用藥范圍提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。七葉皂苷鈉購自上海阿拉丁試劑公司;DMEM完全培養(yǎng)液和胎牛血清購自HyClone;MTT和DAPI購自Sigma;Annexin V-FITC/PI試劑盒購自BD;聚(ADP-核糖)聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PARP］、pro-caspase-3、cleavedcaspase-8、phospho-p42/44 MAPK(Thr202/Tyr204)、phospho-Akt(Ser473)、DR4、DR5和β-actin抗體購自Cell Signaling Technology; GAPDH單克隆抗體購自Bioword;IRDye800熒光標(biāo)記Ⅱ抗購自O(shè)dessey。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HeLa細(xì)胞株在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清和抗生素(1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率HeLa細(xì)胞提前24 h接種于96孔板，每孔細(xì)胞密度大約5×104，細(xì)胞分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理，溶劑對(duì)照組加入DMSO，實(shí)驗(yàn)組加入七葉皂苷鈉，使其終濃度分別為5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L 和100 mg/L，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，將培養(yǎng)液吸盡，加入5 g/L MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h后加入150 μL DMSO溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)，細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A-空白調(diào)零孔A)/(A空白對(duì)照組×100%-空白調(diào)零孔A)×100%。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察提前24 h把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，密度約2×108/L。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組七葉皂苷鈉為10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L。加藥24 h后于倒置顯微鏡下觀察、拍照(×200)。

2.4 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)變化細(xì)胞處理同2.3，用PBS洗3次后，避光DAPI(1 mg/L)染色3 min，再用PBS避光洗3次。染好色的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀測(cè)并拍照分析。

2.5 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率分組處理細(xì)胞，0.25%胰酶消化，800 r/min離心收集細(xì)胞樣品，冷PBS洗2次，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書處理細(xì)胞樣品，即用含Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL的標(biāo)記液重懸細(xì)胞后，避光室溫孵育15 min，加入1×Binding Buffer 400 μL。流式細(xì)胞儀檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析，每次計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞。

2.6 免疫印跡法各組細(xì)胞處理后，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液在冰上孵育30 min，收集細(xì)胞裂解物，4℃、15 000×g離心15 min，收取離心上清液。用紫外分光光度法測(cè)定樣品蛋白濃度。加入上樣緩沖液煮沸5 min，按蛋白含量測(cè)定結(jié)果上等量樣品，進(jìn)行SDS-PAGE(10%或12%)并轉(zhuǎn)移至NC膜上。再將膜置于5%脫脂奶粉的TBS封閉液中封閉1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜，熒光標(biāo)記Ⅱ抗室溫孵育1 h，用Odyssey紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描并計(jì)算信號(hào)條帶熒光值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 七葉皂苷鈉對(duì)HeLa細(xì)胞存活率及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞多呈鋪路石狀，細(xì)胞輪廓清晰;用10 mg/L七葉皂苷鈉處理細(xì)胞24 h后，部分細(xì)胞邊緣收縮，與鄰近細(xì)胞分離、脫壁;40 mg/L組發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞出現(xiàn)空泡、破碎，見圖1。MTT結(jié)果顯示七葉皂苷鈉可以顯著降低HeLa細(xì)胞的存活率，且七葉皂苷鈉對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，見圖2。

Figure 1.Morphology of HeLa cells after sodium aescinate(SA)treatment.圖1 七葉皂苷鈉對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

Figure 2.Sodium aescinate(SA)inhibited the viability of HeLa cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 七葉皂苷鈉對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響

2 七葉皂苷鈉對(duì)HeLa細(xì)胞核形態(tài)的影響

空白對(duì)照組中細(xì)胞核外觀為不規(guī)則橢圓形，染色均勻，呈淺藍(lán)色。用不同濃度七葉皂苷鈉處理后，細(xì)胞核大小不均，染色加深，視野中可見新月形或大小不等的圓形小體，即核小體，見圖3。

3 七葉皂苷鈉對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI結(jié)果顯示，七葉皂苷鈉低濃度組就能引起HeLa細(xì)胞凋亡，中濃度組和高濃度組HeLa細(xì)胞凋亡率顯著增高，呈量-效關(guān)系，見圖4。

4 七葉皂苷鈉對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blotting結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組的凋亡相關(guān)蛋白沒有明顯變化，但隨著七葉皂苷鈉作用濃度的升高，PARP切割顯著增多，cleaved caspase-8和cleaved caspase-9切割帶明顯增強(qiáng)，procaspase-3前體顯著減少，見圖5。

Figure 3.Nuclear morphology of HeLa cells after sodium aescinate(SA)treatment.圖3 七葉皂苷鈉對(duì)HeLa細(xì)胞核形態(tài)的影響

Figure 4.Cell apoptosis induced by sodium aescinate(SA).圖4 七葉皂苷鈉對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

Figure 5.Effects of sodium aescinate(SA)on apoptosis-related proteins.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖5 七葉皂苷鈉對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

5 七葉皂苷鈉對(duì)Akt和ERK信號(hào)通路的影響

不同濃度的七葉皂苷鈉處理HeLa細(xì)胞4 h后，明顯抑制了Akt和ERK的活化，p-Akt和p-ERK蛋白表達(dá)水平明顯減少，見圖6。

6 七葉皂苷鈉對(duì)死亡受體蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，20 mg/L和40 mg/L七葉皂苷鈉能使DR4和DR5的表達(dá)明顯上調(diào)，而10 mg/L組變化不顯著，溶劑對(duì)照組基本沒有變化，見圖7。

Figure 6.Sodium aescinate(SA)inhibited the phosphorylation of Akt and ERK.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖6 七葉皂苷鈉抑制Akt和ERK的磷酸化

Figure 7.Effects of sodium aescinate(SA)on the expression of TRAIL receptors(DR4 and DR5)in HeLa cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖7 七葉皂苷鈉對(duì)TRAIL受體(DR4和DR5)表達(dá)的影響

討論

雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道，七葉皂苷鈉具有抗腫瘤作用［8-10］，但其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用尚未見報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，七葉皂苷鈉能夠顯著降低HeLa細(xì)胞存活率。經(jīng)過七葉皂苷鈉處理的HeLa細(xì)胞，具有典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化特征，包括染色體聚集和細(xì)胞核破碎。Annexin V-FITC/PI實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明七葉皂苷鈉明顯增加HeLa細(xì)胞的凋亡率。以上結(jié)果證實(shí)，七葉皂苷鈉能夠誘導(dǎo)宮頸癌He-La細(xì)胞凋亡，且具有劑量依賴性。

在本研究中，我們首次證實(shí)七葉皂苷鈉通過外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡;在細(xì)胞凋亡的早期階段，caspase-8和caspase-9顯著激活;死亡受體DR4和DR5總蛋白水平在七葉皂苷鈉作用后明顯增加。DR4和DR5又稱為TRAIL受體1和TRAIL受體2，在其胞漿端含有死亡結(jié)構(gòu)域，通過募集接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，向細(xì)胞內(nèi)傳遞凋亡信號(hào)［11］。因此，在HeLa細(xì)胞表面的DR4和DR5表達(dá)增加，可能促進(jìn)下游caspase-8蛋白的激活。七葉皂苷鈉作用HeLa細(xì)胞后，線粒體通透性增加，激活caspase-9形成凋亡小體。Caspase-8和caspase-9的活化可進(jìn)一步引起效應(yīng)蛋白caspase-3的活化及其底物PARP的切割。

眾所周知，多種蛋白激酶途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活。絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogenactivated protein kinases，MAPKs)，在多種細(xì)胞模型中，參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控［12］。MAPKs家族包括3個(gè)成員，分別是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 MAPK。 JNK和p38 MAPK主要發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，而ERK作為細(xì)胞存活調(diào)節(jié)子，在促進(jìn)細(xì)胞存活和細(xì)胞分化中扮演著關(guān)鍵的角色。除了MAPKs家族，另外一個(gè)蛋白激酶Akt通過磷酸化與細(xì)胞死亡相關(guān)的多種因子，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡傷害［12］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，七葉皂苷鈉能夠阻斷ERK和Akt信號(hào)途徑，在濃度為10 mg/L時(shí)ERK和Akt磷酸化水平已經(jīng)顯著下調(diào)，在濃度為40 mg/L時(shí)可見ERK和Akt磷酸化信號(hào)非常弱。因此，七葉皂苷鈉促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡可能與抑制Akt和ERK細(xì)胞存活信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，我們的研究結(jié)果證實(shí)七葉皂苷鈉能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與抑制細(xì)胞存活信號(hào)途徑Akt和ERK有關(guān)。激活外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體途徑也是七葉皂苷鈉觸發(fā)細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制。本研究為臨床制定宮頸癌預(yù)防和治療策略提供有價(jià)值的參考。而且七葉皂苷鈉能夠明顯提高細(xì)胞內(nèi)TRAIL受體DR4和DR5水平，在對(duì)TRAIL不敏感的腫瘤的治療中，能否作為輔助藥物增加腫瘤對(duì)TRAIL的敏感性，將具有很大的研究前景，也是我們下一步研究的方向。

［1］Fu F，Hou Y，Jiang W，et al.Escin:inhibiting inflammation and promoting gastrointestinal transit to attenuate formation of postoperative adhesions［J］.World J Surg，2005，29(12):1614-1620.

［2］王超，韓博，丁曉潔.七葉皂苷鈉對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷SOD的影響［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，4 (6):18-19.

［3］Wang XH，Xu B，Liu JT，et al.Effect of β-escin sodium on endothelial cells proliferation，migration and apoptosis［J］.Vascul Pharmacol，2008，49(4-6):158-165.

［4］楊曉冉，趙保忠，崔景榮.β-七葉皂苷鈉對(duì)雞胚血管新生的影響［J］.中國(guó)新藥雜志，2006，15(11):868-870.

［5］趙保忠，楊曉冉，郭維，等.β-七葉皂苷鈉抗大鼠主動(dòng)脈血管形成作用及機(jī)制初探［J］.中國(guó)新藥雜志，2007，16(17):1357-1360.

［6］Hu JN，Zhu XM，Han LK，et al.Anti-obesity effects of escins extracted from the seeds of Aesculus turbinata BLUME(Hippocastanaceae)［J］.Chem Pharm Bull，2008，56(1):12-16.

［7］Niu YP，Li LD，Wu LM.Beta-aescin:a potent natural inhibitor of proliferation and inducer of apoptosis in human chronic myeloid leukemia K562 cells in vitro［J］.Leuk Lymphoma，2008，49(7):1384-1391.

［8］萬貴平，張真真，蔡雪婷，等.七葉皂苷鈉抑制人白血病Jurkat細(xì)胞增殖的機(jī)制研究［J］.中草藥，2012，43 (1):106-110.

［9］張好生，劉明義，張蓮梅.七葉皂苷的藥理作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2004，6 (3):45-46.

［10］McCubrey JA，Steelman LS，Chappell WH，et al.Ras/ Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR cascade inhibitors:how mutations can result in therapy resistance and how to overcome resistance［J］.Oncotarget，2012，3 (10):1068-1111.

［11］Allen JE，El-Deiry WS.Regulation of the human TRAIL gene［J］.Cancer Biol Ther，2012，13(12):1143-1151.

［12］Siegfried Z，Bonomi S，Ghigna C，et al.Regulation of the Ras-MAPK and PI3K-mTOR signalling pathways by alternative splicing in cancer［J］.Int J Cell Biol，2013，2013: 568931.

Sodium aescinate induces apoptosis of HeLa cells by inhibiting Akt/ERK signaling pathways and increasing death receptor expression

QI Shi-mei，QI Zhi-lin，LING Lie-feng，Lü Jun，ZHANG Yao
(Department of Biochemistry，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China.E-mail:juliaqi@163.com)

AIM:To study the effects of sodium aescinate on the apoptosis of cervical cancer HeLa cells and its molecular mechanism.METHODS:MTT assay was used to detect the growth and proliferation of HeLa cells.The morphological alteration was observed under inverted microscope.Annexin V-FITC/PI double staining and DAPI nuclear staining were used to determine the apoptosis of HeLa cells induced by sodium aescinate.The apoptosis-related proteins PARP，cleaved caspase-8 and pro-caspase-3，and the proliferation-associated molecules Akt and ERK，as well as TRAIL receptors DR4 and DR5 were detected by Western blotting.RESULTS:Sodium aescinate inhibited the growth of HeLa cells in a concentration-dependent manner.Treatment with sodium aescinate induced the typical morphology of apoptotic cells and increased the apoptotic rate significantly.The cleaved PARP，cleaved caspase-8 and cleaved caspase-9 protein expression was observed.The expression of DR4 and DR5 was up-regulated.Meanwhile，pro-caspase-3 was decreased，and the levels of p-Akt and p-ERK were down-regulated by sodium aescinate in a dose-dependent manner.CONCLUSION:Sodium aescinate inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of HeLa cells by increasing death receptor expression and repressing proliferation-associated signaling pathways.

Sodium aescinate;Uterine cervical neoplasms;Apoptosis;Death receptors;Akt pathway;ERK pathway

Q28

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.008

1000-4718(2014)02-0239-06

2013-10-09

2013-12-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31301171);活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(No.1306C083008);高等學(xué)校省級(jí)優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2013SQRL055ZD);皖南醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目

△通訊作者Tel:0553-3932462;E-mail:juliaqi@163.com