rAAV1-SERCA2a轉(zhuǎn)染改善心力衰竭犬心功能及其機制探討*

米亞非，李小鷹，江建軍，付治卿，魯曉春

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院心內(nèi)科，浙江臺州 317000;2解放軍總醫(yī)院老年心血管病一科，北京 100853)

rAAV1-SERCA2a轉(zhuǎn)染改善心力衰竭犬心功能及其機制探討*

米亞非1，李小鷹2△，江建軍1，付治卿2，魯曉春2

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院心內(nèi)科，浙江臺州 317000;2解放軍總醫(yī)院老年心血管病一科，北京 100853)

目的:研究重組1型腺相關(guān)病毒(rAAV1)介導(dǎo)的肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶2a(SERCA2a)基因轉(zhuǎn)移對心力衰竭(HF)犬心功能的作用并探討其機制。方法：采用快速右心室起搏建立比格犬的HF模型，設(shè)對照組、HF組、HF+EGFP組和HF+SERCA2a組(均n=4)。后2組經(jīng)開胸心肌內(nèi)注射rAAV1-EGFP或rAAV1-SERCA2a，劑量為1×1012病毒基因組。結(jié)果:基因轉(zhuǎn)移30 d后，HF+SERCA2a組超聲心動圖左室射血分數(shù)接近對照組，較HF組明顯改善(P＜0.05)，SERCA2a mRNA較HF組顯著提高(P＜0.05)，SERCA2a蛋白在心肌組織中的表達顯著高于HF組(P＜0.05)，心肌細胞凋亡指數(shù)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達較HF組顯著降低(P＜0.05)。HF+EGFP組各項觀察指標(biāo)接近HF組。但是，受磷蛋白mRNA的水平?jīng)]有改變。結(jié)論:rAAV1-SERCA2a轉(zhuǎn)染上調(diào)HF犬心肌組織SERCA2a的表達，能改善心功能，抑制心室重塑;其機制可能與抑制心肌細胞凋亡、下調(diào)MMP-9表達有關(guān)。

心力衰竭;快速右心室起搏;肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶2a;腺相關(guān)病毒

心力衰竭(heart failure，HF)在細胞水平的特征是收縮功能的損害和Ca2+穩(wěn)態(tài)的失衡。Ca2+調(diào)節(jié)不僅決定著心肌收縮，影響心率變化，還對心力衰竭進展過程中的心臟肥厚、重構(gòu)發(fā)揮重要作用，Ca2+調(diào)節(jié)處于心力衰竭病理生理的中心環(huán)節(jié)［1］。研究證明，細胞膜和肌漿網(wǎng)膜上幾個與心肌漿/內(nèi)細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)密切相關(guān)的分子在心衰的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的作用［2-3］。肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA)位于肌漿網(wǎng)膜上，能將Ca2+從細胞質(zhì)重攝取入肌漿網(wǎng)腔內(nèi)，是細胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶［4］。SERCA已經(jīng)分離出了5種亞型，在正常和衰竭心臟中表達的主要是2a亞型(即心臟/慢動作骨骼肌型)。本實驗通過重組1型腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus type 1，rAAV1)介導(dǎo)SERCA2a基因轉(zhuǎn)染，糾正心力衰竭比格犬心肌細胞Ca2+調(diào)節(jié)的紊亂，觀察對心力衰竭比格犬心功能及心室重構(gòu)的影響，通過觀察心肌細胞的凋亡情況和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達，探索SERCA2a作用的機制，為SERCA2a臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材料和方法

1 動物

健康比格犬18只，體重9～12 kg，雌雄各半，解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供。

2 主要試劑和儀器

攜帶SERCA2a的rAAV1(rAAV1-SERCA2a)和攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的rAAV1(rAAV1-EGFP)均由北京本元正陽基因技術(shù)股份有限公司包裝，病毒滴度均為1 ×1015viral genomes/L。MMP-9多克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品;兔多克隆SERCA2a抗體購自Lab Vision; TUNEL試劑盒為Promega產(chǎn)品;山羊抗兔SP檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG均為中杉公司產(chǎn)品。埋藏式VOO固定高頻率起搏器為上海復(fù)旦大學(xué)電子工程系研制，起搏頻率設(shè)有230 beats/min和180 beats/min;起搏電極為Medtronic生產(chǎn);C型臂X線數(shù)字減影機為飛利浦產(chǎn)品;心臟彩色超聲心動圖為通用電器公司產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1 比格犬心力衰竭模型的建立術(shù)前12 h禁食，用3%戊巴比妥鈉按25 mg/kg靜脈麻醉。分離出右頸外靜脈，在X線引導(dǎo)下將電極送至右室心尖。在頸部做一皮囊，置入起搏器，暫停起搏。3 d后通過磁鐵在體外啟動起搏器，起搏器固定頻率230 beats/ min，持續(xù)30 d后。再行手術(shù)換頻率180 beats/min的起搏器，再持續(xù)30 d。術(shù)中和術(shù)后3 d給予青霉素80 U預(yù)防感染。

3.2 基因轉(zhuǎn)染更換起搏頻率為180 beats/min的起搏器時，手術(shù)動物每只注射rAAV1-EGFP或rAAV1-SERCA2a病毒液1 mL。麻醉方法同前，呼吸機支持呼吸。經(jīng)第4肋間進入胸腔，于左室前壁的左冠狀動脈前降支與左冠狀動脈回旋支之間區(qū)域選擇注射點，垂直進針3～5 mm，共選取共10個點依次注射藥液。

3.3 超聲心動圖清醒狀態(tài)的比格犬，左胸前區(qū)備皮，仰臥于檢查臺上，停止起搏30 min后進行超聲心動圖檢查，指標(biāo)有左室收縮期內(nèi)徑(left ventricular diameter during systole，LVSD)、左室舒張期內(nèi)徑(left ventricular diameter during diastole，LVDD)、左室后壁厚度(leftventricularposteriorwalldimension，LVPWD)、射血分數(shù)(ejection fraction，EF)等。

3.4 mRNA檢測基因治療30 d后處死動物，取左心室前壁心肌組織用于檢測SERCA2a和受磷蛋白(phospholamban，PLN)mRNA的表達。

3.4.1 RT-PCR檢測心肌組織中SERCA2a mRNA的表達提取組織中總RNA并取RNA 5 μg進行逆轉(zhuǎn)錄，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL進行PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照。SERCA2a上游引物5’-CAGCTGCTCTGGGTCAATC-3’，下游引物5’-CAGGTTCCAGGTAGTTGCG-3’，擴增片段長度為613 bp。GAPDH上游引物5’-GATGCTGGTGCTGAGTATGT-3’，下游引物5’-CTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’，擴增片段長度為294 bp。PCR反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件為:94℃5 min，變性，94℃30 s，57.4℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，共30個循環(huán)。

3.4.2 RT-PCR檢測組織中PLN mRNA的表達PLN上游引物5’-CAAGCACGTCAAAATCTTCAGA-3’，下游引物5’-CTGGTTAGCAGAGCAGTTTTAAAA-3’，擴增片段長度為438 bp。PCR反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件為:94℃5 min變性，94℃30 s，51.2℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，共30個循環(huán)。取5 μL延伸PCR產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進行計算機圖像分析。

3.5 電鏡檢查取1 mm×1 mm×1 mm心肌組織2～3塊，6%戊二醛固定后依次梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄組織切片，在電子顯微鏡下，觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化，選取典型視野拍照。

3.6 組織中SERCA2a和MMP-9免疫組織化學(xué)染色

組織用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，具體按SP試劑說明書操作。胞漿棕黃色或棕褐色為陽性。采用Leica Qwin圖像分析軟件計算20個高倍視野的吸光度和積分吸光度值。

3.7 心肌細胞凋亡指數(shù)檢測固定心肌組織后制成組織切片，用TUNEL試劑盒檢測。染色后普通光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察，每張切片觀察5個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)，取其平均值。凋亡指數(shù)(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞指數(shù)×100%。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

18只比格犬中，1只比格犬在快速起搏(230 beats/min)30 d后猝死，1只比格犬在30 d后更換起搏器和基因轉(zhuǎn)染后死于嚴重心衰。16只比格犬完成整個實驗過程?？焖儆倚氖移鸩?230 beats/min)30 d后，全部犬均出現(xiàn)活動能力下降、剩食、氣促、腹脹等明顯的心衰表現(xiàn)。更換頻率起搏器(180 beats/ min)后將16只比格犬隨機分為4個組:(1)對照組4只;(2)HF組4只;(3)HF+EGFP組4只;(4) HF+SERCA2a組4只。

1 超聲心動圖結(jié)果

基因轉(zhuǎn)染30 d后，HF組和HF+EGFP組的LVDD、LVSD和LVPWD較對照組和HF+SERCA2a組顯著增高，EF較對照組和HF+SERCA2a組顯著降低(P＜0.05)，說明HF組和HF+EGFP組比格犬心臟收縮功能明顯受損;HF+SERCA2a組的LVDD、LVSD和LVPWD較對照組增高，EF較對照組降低，但差異未達到統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明HF+SERCA2a組心臟收縮功能受損不顯著，見表1。

表1 基因轉(zhuǎn)染30 d后各組比格犬超聲心動圖指標(biāo)Table 1.Echocardiographic data in each group 30 days after gene transfer(Mean±SD.n=4)

2 心肌組織SERCA2a mRNA的表達

RT-PCR發(fā)現(xiàn)，各組心肌組織均見610 bp的條帶。對心肌組織的SERCA2a mRNA的表達進行半定量分析，HF組和HF+EGFP組的SERCA2a mRNA表達與對照組相比顯著降低(P＜0.05)，HF+SERCA2a組與HF組相比顯著增高(P＜0.05)，接近對照組水平，見圖1。

3 心肌組織PLN mRNA的表達

RT-PCR發(fā)現(xiàn)，各組心肌組織均見430 bp的條帶。對心肌組織的PLN mRNA表達進行半定量分析，對照組、HF組、HF+EGFP組和HF+SERCA2a 組PLN的表達沒有顯著差異(P＞0.05)，見圖2。

4 電鏡下超微結(jié)構(gòu)變化

對照組心肌纖維完整，橫紋肌結(jié)構(gòu)清晰，Z線清楚，線粒體結(jié)構(gòu)完好無腫脹，嵴突完好，閏盤結(jié)構(gòu)清晰完好;HF組和HF+EGFP組電鏡下心肌纖維呈變性改變，肌絲片狀溶解、斷裂、排列紊亂、水腫，線粒體膨脹，呈氣球樣變，嵴稀疏，部分嵴突消失，空泡化多見，肌漿網(wǎng)擴張，Z線融合，閏盤解離多見;HF+ SERCA2a組肌絲片狀溶解、斷裂、排列紊亂，但程度較HF組、HF+EGFP組減輕，見圖3。

Figure 3.Cardiomyocytes examined by electron microscopy.A: myocardial fibers and Z lines orderly distributed in control group(×25 000);B:part Z lines aggregated and patchy myocardial fibers dissolved or fractured in HF group(×10 000);C:patchy myocardial fibers dissolved in HF+EGFP group(×40 000);D:myocardial fibers and Z lines orderly distributed in HF+ SERCA2a group(×12 000).圖3 心肌細胞電鏡觀察

5 心肌組織中SERCA2a的表達

SERCA2a主要表達于心肌細胞的胞漿，呈棕黃色，在心肌組織內(nèi)彌漫分布，纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞未見表達，見圖4;其它組織(肝臟、肺臟)未見SERCA2a表達。對各組比格犬的心肌組織SERCA2a的表達進行半定量分析發(fā)現(xiàn)，HF組(吸光度值為0.8744±0.0432，積分吸光度值為31.176±3.354)和HF+EGFP組(吸光度值為0.8768±0.0417，積分吸光度值為31.697±3.146)與對照組(吸光度值為1.0539±0.0486，積分吸光度值為34.563± 2.926)比較顯著降低(P＜0.05)。HF+SERCA2a組心肌細胞的SERCA2a表達(吸光度值為1.1758± 0.0387，積分吸光度值為38.684±3.358)較對照組顯著增高(P＜0.05)，也顯著高于HF組與HF+EGFP組(P＜0.05)。

Figure 4.SERCA2a diffusely expressed in myocardial tissues (SP，×200).A:control;B:HF;C:HF+EGFP; D:HF+SERCA2a.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SERCA2a group.圖4 SERCA2a在心肌組織中的表達

6 心肌細胞凋亡改變

通過TUNEL試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，心肌細胞發(fā)生凋亡后，細胞核呈棕褐色，胞核呈橢圓形或圓形，胞漿淡染，在心肌組織內(nèi)呈散在分布。非凋亡心肌細胞的細胞核被蘇木素染呈深藍色，細胞核呈長橢圓形或桿狀，見圖5。對照組比格犬的心肌細胞未見凋亡細胞。HF組及HF+EGPF組見散在的凋亡心肌細胞，凋亡指數(shù)分別為(4.56±0.29)%和(4.21± 0.31)%，均較對照組顯著增高。HF+SERCA2a組心肌細胞的凋亡指數(shù)為(1.47±0.13)%，較HF組和HF+EGFP組顯著降低(P＜0.01)。

7 心肌組織MMP-9免疫組織化學(xué)染色

MMP-9主要表達于心肌細胞的胞漿，呈棕黃色，散在分布或小片狀表達，見圖6。采用Leica Qwin圖像分析軟件對各組比格犬的心肌組織MMP-9表達進行半定量分析，計算20個高倍視野的吸光度和積分吸光度，發(fā)現(xiàn)HF組MMP-9(吸光度值為0.3147 ±0.0079，積分吸光度值為4.354±0.142)和HF+ EGFP組(吸光度值為0.3082±0.0075，積分吸光度值為4.276±0.139)顯著高于對照組(吸光度值為0.0346±0.0013，積分吸光度值為0.145±0.027) (P＜0.01)。HF+SERCA2a組心肌細胞的MMP-9表達(吸光度值為0.1365±0.0045，積分吸光度值為1.941±0.093)較對照組顯著增高(P＜0.05)，但較HF組、HF+EGFP組顯著降低(P＜0.05)。

Figure 5.Apoptotic index of the myocardial tissues(TUNEL，×200).A:control;B:HF;C:HF+EGFP;D:HF +SERCA2a.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SERCA2a group.圖5 凋亡的心肌細胞

Figure 6.Expression of MMP-9 in myocardial tissues(SP，×400).A:control;B:HF;C:HF+EGFP;D:HF +SERCA2a.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SERCA2a group.圖6 心肌組織MMP-9蛋白的表達

討論

左心室功能不全或心力衰竭時，心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生進行性損害，均表現(xiàn)為心臟重構(gòu)，組織學(xué)上可見心肌細胞凋亡、細胞外膠原沉積和基因/細胞因子活化的增加。多種因素可導(dǎo)致心臟重構(gòu)，其基本過程表現(xiàn)為Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，Ca2+信號通路激活，心肌細胞肥大和結(jié)構(gòu)變化，Ca2+調(diào)節(jié)的改變是心力衰竭發(fā)展的必然通路［5］。有研究表明，靜息期Ca2+持久升高可激活絲/蘇氨酸磷酸化酶而誘導(dǎo)心肌肥厚，促進細胞凋亡。降低舒張期胞內(nèi)Ca2+濃度不僅有益于收縮性，而且能減少磷酸化酶激活，阻斷細胞凋亡和心肌肥厚的發(fā)生［6］。過表達SERCA2a通過增加肌漿網(wǎng)攝取和Ca2+的釋放，降低舒張期胞內(nèi)Ca2+濃度，成為減緩心室重構(gòu)發(fā)生的重要途徑［7］。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SERCA2a基因轉(zhuǎn)染30 d后，左室EF較HF組和HF+EGFP組顯著升高，LVDD 和LVSD較HF組和HF+EGFP組顯著下降，相關(guān)的血流動力學(xué)改變見前期實驗［8］，表明SERCA2a基因治療能改善心肌收縮，減緩心臟重構(gòu)。

SERCA2a基因轉(zhuǎn)染后，經(jīng)RT-PCR和免疫組化均發(fā)現(xiàn)，在HF+SERCA2a組，心肌的SERCA2a表達顯著高于HF組和HF+EGFP組，提示外源基因在心肌組織中獲得了表達。電鏡觀察HF組心肌纖維呈變性改變，肌絲片狀溶解、斷裂、排列紊亂、水腫，線粒體膨脹，呈氣球樣變，肌絲間的間隙增寬，肌漿網(wǎng)擴張，Z線融合，閏盤解離多見。SERCA2a基因轉(zhuǎn)染組心肌纖維完整，Z線清楚，線粒體結(jié)構(gòu)完好、無腫脹，嵴突完好，閏盤結(jié)構(gòu)清晰，說明SERCA2a基因治療能改善心肌病變程度。TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，在HF組和HF+EGFP組，凋亡指數(shù)與對照組相比顯著增加(P＜0.05);而在SERCA2a基因治療30 d組，凋亡指數(shù)與HF組和HF+EGFP組相比顯著減少(P＜0.05)。提示SERCA2a轉(zhuǎn)染可能抑制心肌細胞凋亡。

鈣泵的活性除主要受SERCA2a表達程度影響外，還與一些調(diào)節(jié)因子的表達密切相關(guān)，其中PLN對SERCA功能調(diào)節(jié)作用最為重要。非磷酸化的PLN 與SERCA結(jié)合，通過蛋白-蛋白之間的相互作用，抑制鈣泵與Ca2+的親和力，降低ATP酶的活性;磷酸化的PLN與SERCA解離，減輕對SERCA的抑制，導(dǎo)致SERCA的Ca2+轉(zhuǎn)運速率增加。SERCA蛋白的活化程度則取決于PLN數(shù)量和磷酸化程度，PLN/ SERCA2a比值與心肌的收縮力呈負相關(guān)［9］。本實驗結(jié)果顯示，PLN mRNA表達水平在HF組、HF+EGFP組、HF+SERCA2a組及對照組之間無顯著差異，與Beeri等［10］和Jiang等［11］的報道一致。盡管PLN沒有發(fā)現(xiàn)顯著改變，但隨著SERCA2a水平升高，PLN/ SERCA2a比值下降，心肌收縮力提高。

心肌基質(zhì)金屬蛋白酶活性改變與左室擴張、心室重構(gòu)密切相關(guān)，特別是MMP-9在缺血和非缺血擴張心肌病大量增加，在心力衰竭引起的心室重構(gòu)中的作用受到日益關(guān)注。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在快速起搏所致的心力衰竭組，心肌組織MMP-9表達顯著強于對照組，SERCA2a基因治療30 d組，MMP-9表達較心衰組明顯減弱，說明將SERCA2a基因在心肌局部過表達除改善心力衰竭癥狀外，還可通過減少MMP-9的表達，延緩心衰進程中心室重構(gòu)的進展。

綜上所述，本實驗在大動物模型上，通過基因轉(zhuǎn)染，上調(diào)心肌細胞SERCA2a的表達，能夠改善心臟功能，抑制心室重塑，并對其發(fā)生機理進行了初步探討。SERCA2a基因轉(zhuǎn)導(dǎo)治療晚期心力衰竭的I、II期臨床試驗中取得了較好的效果［12-13］，進一步在大動物模型中探索有效的基因轉(zhuǎn)染方法，研究其改善心臟功能，減緩心室重構(gòu)的機制，將為SERCA2a基因轉(zhuǎn)導(dǎo)治療晚期心力衰竭在臨床的早日應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為提高治療效果、減少臨床風(fēng)險提供新的思路或方法。

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Transfection of rAAV1-SERCA2a improves cardiac function of beagles with heart failure

MI Ya-fei1，LI Xiao-ying2，JIANG Jian-jun1，F(xiàn)U Zhi-qing2，LU Xiao-chun2
(1Department of Cardiology，Taizhou Hospital，Wenzhou Medical University，Taizhou 317000，China;2First Department of Geriatric Cardiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China.E-mail:xyli301@163.com)

AIM:To study the effects of recombinant adeno-associated virus type 1(rAAV1)-sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a(SERCA2a)transfection on the cardiac function of beagles with heart failure (HF).METHODS:The beagles were used to make an animal model with heart failure after rapid right ventricular pacing (230 beats/min)for 30 d.A reduced rate(180 beats/min)was continuously applied for another 30 d.The beagles were divided into 4 groups(n=4):control group，HF group，HF+EGFP group and HF+SERCA2a group.rAAV1-EGFP and rAAV1-SERCA2a(both 1×1012viral genomes)were intramyocardially injected into the animals in the latter 2 groups，respectively.RESULTS:After transfection for 30 d，the left ventricular systolic function in HF+SERCA2a group was similar to that in control group，and significantly higher than that in HF group(P＜0.05).The ratio of SERCA2a mRNA/ GAPDH mRNA was significantly higher in HF+SERCA2a group than that in HF group(P＜0.05).The expression level of SERCA2a in the myocardial tissues was higher in HF+SERCA2a group than that in HF group(P＜0.05).The apoptotic index of the cardiomyocytes and the protein expression of MMP-9 were much lower in HF+SERCA2a group than those in HF group(P＜0.05).No significant difference of all parameters was observed between HF group and HF+EGFP group.The mRNA level of phospholamban was unchanged.CONCLUSION:Transfection of SERCA2a improves the expression of SERCA2a，restores the cardiac function and inhibits left ventricular remodeling by reducing the cardiac cell apoptosis and the MMP-9 expression in the heart failure beagles.

Heart failure;Rapid right ventricular pacing;Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a;Adeno-associated virus

R541.61

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.003

1000-4718(2014)02-0208-06

2013-07-24

2013-12-23

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2006CB503806)

△通訊作者Tel:010-66876231;E-mail:xyli301@163.com