大劑量苯巴比妥對(duì)驚厥幼鼠浦肯野細(xì)胞電生理功能的影響*

譚曉麗， 師長(zhǎng)宏， 任穎鴿， 杜永平， 張?jiān)缕肌?/p>

(第四軍醫(yī)大學(xué)1西京醫(yī)院兒科腦發(fā)育研究室，2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3西京醫(yī)院全軍中醫(yī)內(nèi)科中心，陜西西安 710032)

大劑量苯巴比妥對(duì)驚厥幼鼠浦肯野細(xì)胞電生理功能的影響*

譚曉麗1▲， 師長(zhǎng)宏2▲， 任穎鴿1， 杜永平3△， 張?jiān)缕?△

(第四軍醫(yī)大學(xué)1西京醫(yī)院兒科腦發(fā)育研究室，2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3西京醫(yī)院全軍中醫(yī)內(nèi)科中心，陜西西安 710032)

目的：研究單次大劑量苯巴比妥對(duì)驚厥幼鼠小腦浦肯野細(xì)胞(Purkinje cells，PCs)電生理功能的影響。方法：將健康新生7 d(P7)SD幼鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、驚厥模型組和苯巴比妥組。給予幼鼠腹腔注射戊四氮60 mg/kg制作驚厥模型。苯巴比妥按120 mg/kg一次性腹腔注射。采用全細(xì)胞膜片鉗記錄法在小腦腦片上記錄小腦PCs動(dòng)作電位及PCs興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current，EPSC)的長(zhǎng)時(shí)程抑制(long-term depression，LTD)。結(jié)果：(1)苯巴比妥組幼鼠小腦PCs誘發(fā)動(dòng)作電位的閾值降低，頻率增高。(2)苯巴比妥組幼鼠小腦PCs EPSC幅值在低頻刺激后15 min內(nèi)降低的幅度顯著大于其它2組。結(jié)論：?jiǎn)未未髣┝勘桨捅韧自黾恿梭@厥幼鼠小腦PCs的興奮性，并改變了小腦PCs的突觸功能。

苯巴比妥;驚厥發(fā)作;長(zhǎng)時(shí)程抑制;浦肯野細(xì)胞

驚厥(convulsion)是新生兒時(shí)期常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，其發(fā)生率為1.5‰～18‰［1］。苯巴比妥作為抗驚厥的一線藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。近年來(lái)，苯巴比妥可能對(duì)未成熟腦造成的不良影響備受關(guān)注［2］。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，母孕期使用苯巴比妥可導(dǎo)致胎兒小頭、生長(zhǎng)發(fā)育遲滯、神經(jīng)管缺損、唇腭裂和指趾畸形等宮內(nèi)發(fā)育異常［3］。生后早期多次使用苯巴比妥(phenobarbital，PB)可顯著抑制未成熟腦的海馬區(qū)神經(jīng)元新生細(xì)胞的增殖和存活［4］，甚至單次給予較大劑量苯巴比妥也會(huì)導(dǎo)致幼鼠的腦重量顯著減輕［5］。因此，治療新生兒驚厥時(shí)常規(guī)使用的苯巴比妥負(fù)荷量(20 mg/kg)對(duì)新生兒腦功能是否有不良影響亟待研究。本研究以臨床治療新生兒驚厥常用的負(fù)荷劑量為基礎(chǔ)，換算獲得苯巴比妥在新生幼鼠的用藥劑量［6］。在新生SD幼鼠的腦片上，觀察單次大劑量苯巴比妥對(duì)驚厥后幼鼠小腦主神經(jīng)元浦肯野細(xì)胞(Purkinje cells，PCs)電生理特征和平行纖維(parallelfiber，PF)-PC突觸傳遞的影響。目的是闡明單次大劑量苯巴比妥對(duì)驚厥后幼鼠神經(jīng)元興奮性和突觸功能的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 試劑 NaCl、KCl、NaH2PO4·H2O、MgSO4· 7H2O、CaCl2·2H2O、NaHCO3、葡萄糖、葡萄糖酸鉀、HEPES、EGTA、磷酸肌酸二鈉、Na2ATP、Na3GTP、KOH和戊四氮均購(gòu)自Sigma;PB由第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院提供。

1.2 溶液 人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L):NaCl 126.0，KCl 5.0，NaH2PO4·H2O 1.25，MgSO4·7H2O 2.0，CaCl2· 2H2O 2.0，NaHCO326.0，葡萄糖10.0，pH 7.35～7.45，滲透壓310～320 omOsm/L。電極內(nèi)液成分(mmoL/L):葡萄糖酸鉀 120.0，KCl 5.0，HEPES 10.0，EGTA 5.0，CaCl2·2H2O 0.5，MgSO4·7 H2O 2.0，磷酸肌酸二鈉2.0，Na2ATP 4.0，Na3GTP 0.3，用0.5 mol/L KOH調(diào)pH為7.35～7.45，滲透壓285～300 omOsm/L。

1.3 儀器 振動(dòng)切片機(jī)(VT1000S，Leica)，正置顯微鏡(Zeiss)，微電極操縱儀(Model 285)，放大器(Axon 700A)，模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器(Digidata1322A)，電極拉制儀(P-97)，刺激器(PG4000A)，滲透壓測(cè)定儀(Model 210)，恒流泵(HL-2，上海瀘西儀器廠)。

2 方法

2.1 驚厥動(dòng)物模型的制備及PB劑量的確認(rèn) 健康新生7 d(P7)SD幼鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。給予幼鼠腹腔注射戊四氮60 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［7］分為5級(jí)。選擇V級(jí)視為驚厥全面發(fā)作作為驚厥模型。PB治療新生兒驚厥的臨床負(fù)荷劑量是20 mg/kg，依據(jù)人與大鼠體表面積換算公式［6］確定幼鼠PB相當(dāng)于臨床負(fù)荷量的劑量為120mg/kg，一次性腹腔注射給藥。

2.2 動(dòng)物分組 正常對(duì)照組:SD幼鼠不制造驚厥模型，一次性腹腔注射與 PB等容積的生理鹽水(normal saline，NS);驚厥模型組(seizure):SD幼鼠驚厥全面發(fā)作后，一次性腹腔注射與PB等容積的生理鹽水;PB組:SD幼鼠驚厥全面發(fā)作后，一次性腹腔注射120 mg/kg PB。每組動(dòng)物均為10只，各組幼鼠腹腔注射后30 min處死取小腦。

2.3 腦片制備 取各組SD幼鼠小腦，放入充95% O2+5%CO2混合氣的0℃ ACSF中，約1 min后取出，修整后移入切片槽內(nèi)固定，用振動(dòng)切片機(jī)切出300 μm厚腦片，立即轉(zhuǎn)移至32℃ ACSF中孵育約30 min，移至室溫下繼續(xù)孵育1 min后開(kāi)始記錄。整個(gè)過(guò)程通以95%O2+5%CO2混合氣體。

2.4 全細(xì)胞膜片鉗記錄 將腦片移至記錄浴槽內(nèi)，先在低倍鏡下確定小腦皮層的細(xì)胞層，再在高倍鏡下選擇表面光滑、輪廓清晰、立體感強(qiáng)的浦肯野細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。玻璃微電極充灌內(nèi)液后電阻為7～9 MΩ，鉗制電壓為-70 mV。記錄過(guò)程中使用恒流泵持續(xù)向記錄浴槽內(nèi)灌注含95%O2+5% CO2混合氣體的ACSF，流速為2 mL/min。在保持膜電位為-70 mV的電流鉗狀態(tài)下，通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)注射去極化電流(50～800 pA，100 ms)誘發(fā)記錄細(xì)胞的動(dòng)作電位。用充有ACSF的玻璃微電極刺激小腦腦片的分子層，誘發(fā)并記錄小腦浦肯野細(xì)胞的興奮性突觸 后 電 流 (excitatory postsynaptic current，EPSC)。長(zhǎng)時(shí)程抑制(long-term depression，LTD)則以一串頻率為1Hz的300個(gè)脈沖組成的低頻刺激(low-frequency stimulation，LFS)誘發(fā)，LFS刺激后的EPSC記錄時(shí)間為30 min以上，記錄期間膜鉗制電壓為-70 mV。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采集使用pCLAMP軟件，數(shù)據(jù)測(cè)量使用Clampfit軟件。數(shù)據(jù)應(yīng)用Origin 8.0分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因數(shù)方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 單次大劑量苯巴比妥對(duì)幼鼠小腦PCs興奮性的影響

在正常對(duì)照組腦片上，細(xì)胞內(nèi)注射去極化電流誘發(fā)PCs動(dòng)作電位的閾值為(172.90±13.21)mV。驚厥模型組的閾值為(165.20±10.64)mV，與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖1B。苯巴比妥組的閾值為(113.60±13.64)mV，與正常對(duì)照組相比有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)圖1B;與驚厥對(duì)照組相比也有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)圖1B。同時(shí)，驚厥模型組誘發(fā)PCs動(dòng)作電位的頻率較正常對(duì)照組升高(P＜0.05)，見(jiàn)圖1C。苯巴比妥組誘發(fā)PCs動(dòng)作電位的頻率較正常對(duì)照組有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)圖1C;與驚厥模型組相比也有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)圖1C。這表明苯巴比妥組幼鼠小腦PCs興奮性較其它2組明顯升高。

Figure 1.Effect of phenobarbital on the excitability of the PCs in neonatal rats with seizures.A:the typical firing of PCs evoked by 400 pA current injection.The membrane potential was hold at-70 mV.B:the threshold of action potential of PCs.C: different current intensity-evoked firing rate of PCs.Mean±SD.n=11.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs seizure;#P＜0.05;##P＜0.01 vs control.圖1 苯巴比妥對(duì)驚厥幼鼠小腦PCs興奮性的影響

2 單次大劑量苯巴比妥對(duì)幼鼠小腦PF-PC突觸可塑性的影響

低頻刺激小腦PF，可使PCs EPSC呈現(xiàn)LTD。各組給予低頻刺激后EPSC幅值均明顯降低。正常對(duì)照組PCs的EPSC幅值在低頻刺激后15 min內(nèi)逐漸降低到基線的(78.03±12.55)%，低頻刺激后持續(xù)穩(wěn)定于該水平。驚厥模型組EPSC幅值在低頻刺激后15 min內(nèi)降低到基線的(74.69±11.58)%，然后持續(xù)穩(wěn)定于該水平。驚厥模型組EPSC幅值的下降幅度與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖2B;苯巴比妥組的幅值在低頻刺激后15 min內(nèi)迅速降低到基線的(62.69±10.56)%，低頻刺激后15～30 min，EPSC幅值恢復(fù)到基線水平的(72.69± 9.58)%并穩(wěn)定維持。苯巴比妥組EPSC幅值降低的程度在低頻刺激后的15 min內(nèi)顯著大于正常對(duì)照組和驚厥模型組，均有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)圖2B。而在低頻刺激后15～30 min，3組的幅值變化無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖2C。這表明苯巴比妥改變了小腦PC的突觸活動(dòng)。

討論

本研究發(fā)現(xiàn)單次大劑量使用苯巴比妥對(duì)驚厥幼鼠小腦PCs的影響有2個(gè)方面，一是導(dǎo)致PCs興奮性增高，二是改變了小腦PCs的突觸活動(dòng)。

早先的臨床研究表明，苯巴比妥即使在常規(guī)用量和規(guī)范用藥的情況下仍可出現(xiàn)不良反應(yīng)，加重驚厥的發(fā)作是其不良反應(yīng)之一。黃鐵栓等［8］回顧總結(jié)了自1998年10月～2003年7月診治的服抗癲癇藥物后發(fā)作加重的45例兒童癲癇患者，其中因服用苯巴比妥加重發(fā)作者6例。蔣莉等［9］臨床研究也發(fā)現(xiàn)苯巴比妥在血藥濃度正常時(shí)可引起肌陣攣、肌強(qiáng)直發(fā)作增加。本研究結(jié)果顯示驚厥幼鼠使用苯巴比妥后PCs興奮性反比正常對(duì)照組和驚厥模型組增高，這可能是臨床上苯巴比妥加重驚厥的機(jī)制之一。苯巴比妥使驚厥幼鼠PCs興奮性增高的機(jī)制可能與未成熟腦γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)驅(qū)動(dòng)的抑制系統(tǒng)不健全有關(guān)，即當(dāng)GABA受體激活使Cl-通道開(kāi)放時(shí)，由于未成熟腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度高于細(xì)胞外，導(dǎo)致Cl-外流，引起膜去極化，從而使神經(jīng)元興奮性增高。此外，大劑量苯巴比妥可能抑制了小腦環(huán)路的抑制性中間神經(jīng)元，使PCs脫抑制，從而導(dǎo)致閾值減低和放電頻率增加。

Figure 2.Effect of phenobarbital on EPSC LTD of the PCs in neonatal rats with seizures.A(left):pooled data for EPSC LTD of the PCs induced by low-frequency stimulation(LFS);A(right):the examples of average EPSC before and after LFS.Each waveform is the average of six traces(every 10 s).Black，red and blue represents EPSC before LFS，first 15 min after LFS and 15～30 min after LFS，respectively.B:normalized EPSC amplitude during the first 15 min after LFS(data from a shown in A);C:normalized EPSC amplitude during 15～30 min after LFS(data from b shown in A).Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs seizure.圖2 苯巴比妥對(duì)驚厥幼鼠小腦PCs EPSC LTD的影響

LTD是中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的一種重要模式［10］。小腦LTD在運(yùn)動(dòng)性學(xué)習(xí)記憶中起重要作用［11］。行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期暴露于苯巴比妥的鼠在八臂迷宮試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)等空間學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中顯示能力下降［12］。但是，苯巴比妥是否影響幼鼠小腦LTD的誘導(dǎo)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)單次給予大劑量苯巴比妥使PCs的EPSC在低頻刺激后早期下降的幅度顯著大于正常對(duì)照組和驚厥模型組，表明苯巴比妥改變了小腦LTD的表達(dá)模式。這一結(jié)果表明，即使是單次給予大劑量苯巴比妥也會(huì)改變小腦PCs的突觸功能，可能對(duì)幼鼠的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能產(chǎn)生不良影響。

谷氨酸作為一種主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)受體介導(dǎo)的興奮性機(jī)制在驚厥的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用［13］。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA)是2種谷氨酸遞質(zhì)門(mén)控受體亞型，每種亞型都是一種遞質(zhì)門(mén)控離子通道，二者介導(dǎo)了腦內(nèi)大多數(shù)快速興奮性突觸傳遞過(guò)程［14］。LTD的誘導(dǎo)與NMDA和AMPA的活動(dòng)密切相關(guān)［15］。單次大劑量苯巴比妥引起的小腦LTD表達(dá)模式的改變提示其可能對(duì)NMDA和AMPA受體活動(dòng)產(chǎn)生了影響。

綜上所述，單次大劑量苯巴比妥使驚厥幼鼠PCs興奮性增高，小腦LTD表達(dá)模式異常，可能是苯巴比妥加重驚厥和導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙等不良反應(yīng)的重要機(jī)制。本研究結(jié)果提示，臨床使用負(fù)荷量苯巴比妥治療新生兒驚厥時(shí)一定要嚴(yán)格掌握適應(yīng)癥，以減少苯巴比妥對(duì)新生兒腦發(fā)育可能造成的不良影響。

［1］ 廖亮榮.新生兒難治性驚厥的治療進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10(8):494-495.

［2］Zuppa AA，Carducci C.Infants bore to mothers under phenobarbital treatment:correlation between serum levels and clinical feature of neonates［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2011，159(1):53-56.

［3］Ornoy A.Neuroteratogens in man:an overview with special emphasis on the teratogenicity of antiepileptic drugs in pregnancy［J］.Reprod Toxicol，2006，22(2):214-226.

［4］Chen J，Cai F，Cao J，et al.Long-term antiepileptic drug administration during early life inhibits hippocampal neurogenesis in the developing brain［J］.J Neurosci Res，2009，87(13):2898-2907.

［5］Bittigau P，Sifringer M，Genz K，et al.Antiepileptic drugs and apoptotic neurodegeneration in the developing brain［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(23): 15089-15094.

［6］ 徐書(shū)云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:200-204.

［7］Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure［J］.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32(3):281-294.

［8］黃鐵栓，朱金蘭，李 冰，等.抗癲癇藥物加重兒童癲癇發(fā)作的臨床研究［J］.中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2004，6 (5):401-402.

［9］ 蔣 莉.抗癲癇藥物治療中值得注意的問(wèn)題［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2005，20(4):382-384.

［10］占祖兵，杜嚴(yán)華.長(zhǎng)時(shí)程抑制在學(xué)習(xí)記憶中的作用及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.生物物理學(xué)報(bào)，2004，20 (5):337-343.

［11］唐 玲，唐榮偉，唐 晶，等.突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，27(1): 89-92.

［12］陳 錦，蔡方成.抗癲癇藥對(duì)未成熟腦發(fā)育的影響［J］.中華兒科雜志，2009，47(2):153-156.

［13］李 晶，杜永平，張?jiān)缕?缺氧對(duì)谷氨酸能和GABA能突觸傳遞的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29 (2):371-375.

［14］彭毓棻，宋 治.NMDA受體在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27(6):1230-1233.

［15］Opazo P，Sainlos M，Choquet D.Regulation of AMPA receptor surface diffusion by PSD-95 slots［J］.Curr Opin Neurobiol，2012，22(3):453-460.

Effect of high-dose phenobarbital on electrophysiological characteristics of Purkinje cells in neonatal rats with seizures

TAN Xiao-li1，SHI Chang-hong2，REN Ying-ge1，DU Yong-ping3，ZHANG Yue-ping1
(1Laboratory of Brain Development，Pediatric Department，Xijing Hospital，2Laboratory Animal Center，3Department of Traditional Chinese Medicine，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China.E-mail: ypzhang@fmmu.edu.cn;ddyypp@fmmu.edu.cn)

AIM:To investigate the effect of single high-dose phenobarbital(PB)on the electrophysiological characteristics of cerebellar Purkinje cells(PCs)in neonatal rats with seizures.METHODS:Seven-day-old Sprague-Dawley neonatal rats were randomly divided into control group，seizure group and PB group.Seizures were induced by pentetrazole(60 mg/kg，ip)，and PB(120 mg/kg，ip)was applied to neonatal rats in PB group.The evoked action potential and excitatory postsynaptic current(EPSC)long-term depression(LTD)of the PCs were recorded by the technique of whole-cell patch clamp on the cerebellar slices.RESULTS:PB decreased the threshold of action potential in the PCs and increased the fire rate.During the first 15 min after stimulation，LTD was induced，and the inhibition of EPSC of the PCs was enhanced significantly by PB.CONCLUSION:Single high-dose PB increases the excitability of PCs and changes the synaptic functions of cerebellar PCs in the neonatal rats with seizures.

Phenobarbital;Convulsive seizures;Long-term depression;Purkinje cells

R722

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.025

1000-4718(2014)03-0529-05

2013-11-06

2014-01-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30871029);第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院助推計(jì)劃(No.XJZT10T07)

△通訊作者張?jiān)缕糡el:029-84773367;E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn;杜永平Tel:029-84771307;E-mail:ddyypp@fmmu.edu.cn

▲并列第1作者