VEGF在SD大鼠Walker-256肝轉(zhuǎn)移瘤模型建立中的應(yīng)用*

劉 妮， 楊建勇， 黃勇慧， 陳 斌， 陳 偉， 李家平

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射介入科，廣東廣州 510080)

VEGF在SD大鼠Walker-256肝轉(zhuǎn)移瘤模型建立中的應(yīng)用*

劉 妮， 楊建勇， 黃勇慧△， 陳 斌， 陳 偉， 李家平

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射介入科，廣東廣州 510080)

目的：探討采用血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)縮短SD大鼠Walker-256肝轉(zhuǎn)移瘤成模時間的安全性與可行性，為抗VEGF靶向藥物的研究提供更實用的模型。方法：將SD大鼠隨機分為3組，每組各15只。生理鹽水(NS)模型組:于建模前1周開始尾靜脈注射生理鹽水0.1 mL/d;20 mg/L VEGF模型組:于建模前1周開始尾靜脈注射20 mg/L VEGF(0.1 mL/d);40 mg/L VEGF模型組于建模前1周開始尾靜脈注射40 mg/L VEGF(0.1 mL/d)。各組均注射至建模當天。建模方法:暴露大鼠肝臟，將瘤塊種植于肝包膜下。分別于建模后3 d、1周和2周用磁共振成像(MRI)觀察腫瘤生長情況，并記存活時間。結(jié)果：建模成功，肝內(nèi)腫塊HE染色符合惡性腫瘤特點。大鼠肝臟MRI表現(xiàn):腫塊呈結(jié)節(jié)狀，T2WI呈稍高信號，顯示更為清楚，腹水于T2WI呈高信號。NS模型組和20 mg/L VEGF模型組各有1只動物于建模后1 d死亡，40 mg/L VEGF模型組有3只于建模1周后死亡。建模后3 d各組可觀察到腫塊的大鼠數(shù)分別為:NS模型組0只，20 mg/L VEGF模型組7只，40 mg/L VEGF模型組10只;建模后1周各組可觀察到腫塊的大鼠數(shù)分別為:NS模型組3只，20 mg/L VEGF模型組14只，40 mg/L VEGF模型組13只;建模后2周各組可觀察到腫塊的大鼠數(shù)分別為:NS模型組12只，20 mg/L VEGF模型組14只，40 mg/L VEGF模型組10只。20 mg/L VEGF模型組和40 mg/L VEGF模型組分別與NS模型組相比，3 d可觀察到成瘤的老鼠數(shù)目差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。NS模型組與20 mg/L VEGF模型組大鼠存活時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，40 mg/L VEGF模型組存活時間短于NS模型組(P＜0.01)。結(jié)論：20 mg/L VEGF能縮短SD大鼠肝轉(zhuǎn)移瘤成模時間，對其存活時間無顯著影響，且相較于傳統(tǒng)模型，更適合應(yīng)用于抗VEGF靶向藥物的研究。

肝轉(zhuǎn)移瘤;模型，動物;血管內(nèi)皮生長因子

目前有大量動物實驗研究為肝癌的臨床治療提供基礎(chǔ)依據(jù)［1］。在這些研究中，肝癌動物模型一直是肝癌相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究工作的重要工具。理想的動物模型建立是研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及療效的重要手段。SD大鼠Walker-256肝轉(zhuǎn)移瘤模型是常用的一種，目前此模型的建立已有較成熟的方法［2］，但是如何在此基礎(chǔ)上縮短成瘤時間，提高實驗效率，近10年來并無較大進展。且隨著血管內(nèi)皮細胞生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)靶向藥物的研究問世，VEGF在腫瘤發(fā)展中的作用越來越受到重視，如何使模型更適合抗VEGF藥物的相關(guān)研究也并無報道。本文旨在探討VEGF在SD大鼠Walker-256肝轉(zhuǎn)移瘤模型中應(yīng)用的安全性與可行性，以期縮短成瘤時間，并使其更接近地模擬腫瘤發(fā)展過程中VEGF的變化，為相關(guān)抗VEGF靶向藥物的基礎(chǔ)研究提供更實用的動物模型。

材料和方法

1 動物與瘤株

2周齡雄性Wistar大鼠2只，供腹腔傳代用，80～100 g雄性Wistar大鼠2只，供大腿內(nèi)側(cè)接種癌性腹水用，200～250 g雄性SD大鼠45只，供接種肝內(nèi)腫瘤用。以上大鼠均為SPF級，購自中山大學(xué)實驗動物中心。Walker-256瘤細胞株購自中山大學(xué)動物實驗中心細胞庫。Recombinant Rat VEGF165試劑，規(guī)格為每支20 μg，購自Peprotech。醫(yī)用明膠海綿購自南京金陵制藥廠。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)使用Siemens Magnetom Avanto 3.0T超導(dǎo)磁共振掃描儀。

2 Walker-256瘤細胞的獲取

Walker-256瘤細胞株復(fù)蘇后，接種于出生2周齡雄性Wistar大鼠腹腔內(nèi)。待7～14 d，大鼠有血性腹水后，用注射器抽取5 mL癌性腹水，離心5 min (離心半徑5 cm，1 200 r/min)。將離心后試管內(nèi)下層糊狀濃縮的瘤細胞懸液接種于2只80～100 g雄性Wistar大鼠的大腿內(nèi)側(cè)皮下，每只注射一側(cè)大腿量約1 mL(內(nèi)約含2×107個瘤細胞)。待7～10 d，可見注射處皮下長出直徑約1 cm左右腫瘤。

3 SD大鼠肝癌模型制作

取傳代鼠大腿皮下腫瘤魚肉樣部分0.5～1.0 mm小塊備用，模型鼠用200～250 g雄性SD大鼠，暴露肝臟，擠出1個肝葉，用眼科剪刺入肝葉表面約1/3，然后用眼科鑷夾取上述小方塊腫瘤組織插入肝內(nèi)，剪5 mm×5 mm明膠海綿覆蓋創(chuàng)面，把肝葉還納，檢查無滲血后即可關(guān)腹。將45只SD大鼠放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，4只Wistar大鼠脫頸椎處死。使用VEGF前將其離心30 s(離心半徑 5 cm，10 000 r/min);使用去離子水100 μL溶解;最后使用PBS溶液稀釋VEGF溶液至所需濃度，根據(jù)預(yù)實驗初步探討VEGF劑量。實驗分組:生理鹽水(normal saline，NS)模型組:于建模前1周開始尾靜脈注射生理鹽水0.1 mL/d;20 mg/L VEGF模型組:于建模前1周開始尾靜脈注射20 mg/L VEGF(0.1 mL/d);40 mg/L VEGF模型組:于建模前1周開始尾靜脈注射40 mg/L VEGF(0.1 mL/d)。各組均注射至建模當日。

4 影像學(xué)檢查及病理學(xué)檢查

根據(jù)預(yù)實驗，VEGF組1周后磁共振掃描發(fā)現(xiàn)部分大鼠成瘤較大，故本次實驗的Siemens Magnetom Avanto 3.0T超導(dǎo)磁共振掃描儀用小線圈，分別于建模后3 d、1周和2周對43只雄性SD大鼠進行掃描。掃描序列為T1WI和T2WI。實驗后期從建模成功的大鼠中隨機抽取3只大鼠，取出肝臟作病理學(xué)檢查，采用HE染色，觀察肝癌組織的病理特點，以驗證肝內(nèi)腫瘤種植是否成功。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，對3組中3 d后可觀察到腫塊的大鼠數(shù)目使用Χ2檢驗分析其統(tǒng)計學(xué)意義，大鼠存活時間采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank檢驗評價存活時間差異有無統(tǒng)計學(xué)意義。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 建模成功與影像學(xué)檢查

MRI檢查可觀察到各組大鼠建模成功率高。建模后第1天，NS模型組和20 mg/L VEGF模型組各有1只死亡。40 mg/L VEGF模型組有3只于建模后1周死亡。建模后2周各組分別有3只、5只和7只出現(xiàn)腹水。MRI表現(xiàn):腫塊呈結(jié)節(jié)狀，T2WI呈稍高信號，顯示更為清楚，腹水于T2WI呈高信號，見圖1。腫塊HE染色符合惡性腫瘤特點，見圖2。

Figure 1.The magnetic resonance imaging(MRI)of the rat liver 2 weeks after modeling.A:NS group;B:20 mg/L VEGF group; C:40 mg/L VEGF group.The tumor(arrows)showed slightly hyperintense signals in T2WI.No significant difference among the 3 groups in tumor size and morphology was observed.C showed a hyperintense signal(T2WI)in the abdomen，suggesting there was some ascites.圖1 肝臟MRI顯示腫瘤形成

Figure 2.Morphological changes of liver tissue in the rat with liver metastatic tumor(HE staining，×200).圖2 肝轉(zhuǎn)移瘤模型大鼠肝臟光鏡下形態(tài)

2 存活時間

43只大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至死亡，觀察大鼠的生存狀態(tài)及終末生存時間，可以發(fā)現(xiàn)大鼠肝內(nèi)種植初期形態(tài)、精神如常，NS模型組和20 mg/L VEGF模型組大鼠分別于建模后20 d和18 d出現(xiàn)體重下降，食量減小，行動減少，精神不佳，毛色無光澤，后期大部分出現(xiàn)腹部膨隆。40 mg/L VEGF模型組建模后1周3只大鼠因腫瘤進展死亡，剩余大鼠也有不同程度消瘦、腹部膨隆。3組大鼠存活時間見表1，中位存活時間分別是27 d(95%置信區(qū)間:25.18～28.82 d)、25 d(95%置信區(qū)間:22.25～27.75 d)和15 d(95%置信區(qū)間:13.11～16.89 d)。Log-rank檢驗評價NS模型組與20 mg/L VEGF模型組生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，NS模型組與40 mg/L VEGF模型組生存時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且40 mg/L VEGF模型組生存時間小于NS模型組，見圖3。

表1 45只大鼠終末生存期Table 1.The overall survival of the rats with different treatments (d)

3 VEGF建模的時間-效應(yīng)關(guān)系

建模后3 d各組可觀察到腫塊的大鼠數(shù)分別為: NS模型組0只，20 mg/L VEGF模型組7只，40 mg/L VEGF模型組10只;建模后1周各組可觀察到腫塊的大鼠數(shù)分別為:NS模型組3只，20 mg/L VEGF模型組14只，40 mg/L VEGF模型組13只;建模后2周各組可觀察到腫塊的大鼠數(shù)分別為:NS模型組12只，20 mg/L VEGF模型組14只，40 mg/L VEGF模型組10只，見圖4?？ǚ綑z驗顯示20 mg/L VEGF模型組與NS模型組、40 mg/L VEGF模型組與NS模型組3 d可觀察到成瘤的大鼠數(shù)目差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。

Figure 3.Survival curves of the rats in the 3 groups.The median survival time of the rats in the 3 groups was 27 d，25 d and 15 d，respectively.No significance in survival time was observed between NS group and 20 mg/L VEGF group by log-rank test(P＞0.05)，while the survival time in 40 mg/L VEGF group was less than that in NS group(P＜0.01).圖3 3組大鼠生存曲線

Figure 4.The relationship between the time of survival and the efficacy of tumor transplantation.圖4 各組模型的時間-效應(yīng)關(guān)系圖

討論

文獻報道［3-4］肝臟是惡性腫瘤血源性轉(zhuǎn)移最好發(fā)的部位，其中有25%～50%的原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟，消化系統(tǒng)約60%～80%最終發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移。肝臟轉(zhuǎn)移是胃腸道惡性腫瘤治療失敗的最主要原因，不經(jīng)治療的肝轉(zhuǎn)移患者，中位生存期僅6個月［4-5］。探索肝轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生規(guī)律，尋求有效的預(yù)防和治療措施一直是實驗研究的熱點。Walker-256腫瘤是大鼠自發(fā)的乳腺癌品系，由其構(gòu)建的肝轉(zhuǎn)移瘤動物模型具有取材方便、可控性強的特點，是研究肝轉(zhuǎn)移瘤的常用模型［6］。根據(jù)傳統(tǒng)成模方法，成功建立肝轉(zhuǎn)移瘤模型需1個月左右時間，若能縮短成瘤時間，可節(jié)省實驗時間，從而加快實驗進度。VEGF作為血管生成的主要調(diào)控因子，特異性的作用于血管內(nèi)皮細胞，促進血管生成，從而使腫瘤生長［7-8］，在腫瘤進展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視。根據(jù)此藥理機制，若提高血液中VEGF濃度可促進腫瘤生長，但濃度過低，可能觀察不到效果，濃度過高，容易使腫瘤進展過快，適合的VEGF濃度是縮短成瘤時間的關(guān)鍵。本實驗結(jié)果表明，在傳統(tǒng)SD大鼠Walker-256肝轉(zhuǎn)移瘤模型的方法上加用20 mg/L VEGF可以縮短成瘤時間。此舉可提高實驗效率，而且使用此濃度的VEGF并未造成老鼠生存期縮短，這也避免了后期對腫瘤進一步研究時因為生存時間縮短而造成腫瘤治療時間縮短、療效觀察不佳等弊端。

VEGF與腫瘤，特別是胃腸道腫瘤本身的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］，而肝轉(zhuǎn)移瘤的介入治療在使腫瘤壞死的同時，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量VEGF，從而促進腫瘤復(fù)發(fā)［10］。目前臨床上已有部分抗VEGF藥物上市，如治療肝細胞與腎癌的索拉非尼、治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的安維汀等?？筕EGF靶向藥物的研究將是未來腫瘤治療的一大方向。本實驗在原有動物模型的基礎(chǔ)上人為注射VEGF，增加大鼠血液VEGF濃度，相較于傳統(tǒng)模型，更接近腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)時VEGF升高的特點，更適合作為抗VEGF藥物基礎(chǔ)研究的動物模型。

關(guān)于VEGF在大鼠模型中的應(yīng)用，如治療重癥胰腺炎、血管栓塞，國內(nèi)外有相關(guān)文獻報道，但多數(shù)采取一次性較高濃度注射以達到促進病變部位新生血管形成的目的［11-12］。本實驗未套用上述研究的注射方法，依據(jù)腫瘤復(fù)發(fā)時VEGF濃度變化規(guī)律，改用低劑量連續(xù)靜脈注射方法，以模擬腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中VEGF的變化，并在實驗中觀察到陽性結(jié)果，既往尚無文獻報道。實驗采用的 Recombinant Rat VEGF165試劑易于購得，保存方法簡單，保存時間長，價格適中。實驗根據(jù)相關(guān)文獻報道［10］選擇MRI檢查作為評價腫瘤形態(tài)、大小的影像學(xué)標準，且后期病理學(xué)檢查顯示細胞可見明顯異型性，其形態(tài)、大小與MRI檢查結(jié)果相符。

綜上所述，在傳統(tǒng)肝轉(zhuǎn)移瘤模型的基礎(chǔ)上加用適當濃度的VEGF是安全可行的，提高了實驗效率，且這一方法模擬了腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)時VEGF升高的特點，更適合用于抗VEGF藥物基礎(chǔ)研究。本實驗僅使用20 mg/L和40 mg/L VEGF進行研究，觀察到濃度為20 mg/L VEGF是安全可行的，但最佳濃度需要更進一步實驗探討。

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Role of VEGF in establishment of Walker-256 transplanted liver cancer model in SD rats

LIU Ni，YANG Jian-yong，HUANG Yong-hui，CHEN Bin，CHEN Wei，LI Jia-ping
(Department of Interventional Radiology，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:13710397492@163.com)

AIM:To evaluate the safety and feasibility of using vascular endothelial growth factor(VEGF)in the establishment of Walker-256 transplanted liver cancer model.METHODS:SD rats(n=45)were divided into 3 groups:via the caudal vein，the rats in normal saline(NS)group were injected with 0.9%sodium chloride(0.1 mL/d)，the rats in 20 mg/L VEGF group were injected with 20 mg/L VEGF(0.1 mL/d)，and the rats in 40 mg/L VEGF group were injected with 40 mg/L VEGF(0.1 mL/d).All the injection began 1 week before transplantation of liver cancer，and stopped on the day the cancer model was established.Prepared tumor tissue was transplanted into the subcapsular space of the liver.Three days，1 week and 2 weeks after the transplantation，magnetic resonance imaging(MRI)was performed for analyzing the tumor growth and the characteristics.The overall survival of the rats was also recorded.RESULTS:Successful establishment of Walker-256 transplanted liver cancer model was achieved.Among 45 rats，1 rat died 1 d after implanting the tumor both in NS group and 20 mg/L VEGF group，while 3 rats died in 40 mg/L VEGF group 1 week after building the model，mainly because of the progression of tumors.Three days after modeling，the numbers of the rats in which the tumor was positively detected by MRI in 3 groups were 0，7 and 10，respectively;1 week after modeling，those were 3，13 and 13，respectively;2 weeks after modeling，those were 12，13 and 10，respectively.Between NS group and 20 mg/L VEGF group，the statistical significance existed in the number of the rats in which the tumor was positively detected by MRIafter 3 d of implanting，so did the NS group and 40 mg/L VEGF group.No statistical significance in the overall survival time between NS group and 20 mg/L VEGF group(P＞0.05)was observed，but the significance existed between 40 mg/ L VEGF group and NS group(P＜0.01).CfONCLUSION:The application of VEGF at dose of 20 mg/L and 0.1 mL/ d shortens the time to establish the transplanted liver cancer model without influence on the overall survival，which is a safe，feasible and efficient way，and is more suitable for anti-VEGF drug investigation.

Liver metastasis neoplasms;Models，animal;Vascular endothelial growth factor

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.033

1000-4718(2014)03-0567-05

2013-11-18

2014-01-13

廣東省科技計劃(No.2012B031800076)

△通訊作者Tel:020-87755766-8723;E-mail:13710397492@163.com