響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取黑豆皮色素的工藝研究

王玲麗，郭艷茹

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000)

黑豆又稱黑大豆，為豆科植物大豆(Glycine max)的黑色種子，有祛風(fēng)除熱、保腎健脾、活血、利尿、解毒、明目之功效，其藥食俱佳，既可以作為食品又可以作為藥材［1］。黑豆皮，中藥稱“料豆衣”，有解毒利尿的功效，含有大量紅色素，飛燕草素－3－葡萄糖苷和矢車菊素－3－葡萄糖苷為其主要成份［2］。從黑豆種皮中提取的黑豆皮色素屬花色苷類化合物，其色彩鮮明，有良好的染色作用，是一種理想的天然色素和重要的食品添加劑［3］。另外黑豆的色素和多糖有很強(qiáng)的抗氧化功能，其清除自由基能力甚至高于黑米［4］，其清除能力是維生素C的116倍［5］。張瑞芬等研究了黑豆種皮提取物對(duì)老齡小鼠具有延緩衰老作用［6］。黑豆花青素有調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的滲透作用，可以改善微循環(huán)，還會(huì)影響免疫功能［7］。一些化學(xué)合成色素有慢性毒性，甚至一些還有致癌性，潛在的危害促使人們尋找新的、安全的可食用色素［8］。黑豆皮紅色素作為食品添加劑，綠色、健康，相比于合成色素，安全性更高，具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療作用，并且由于易得的原料，生產(chǎn)技術(shù)簡(jiǎn)單，因此受到越來(lái)越多的消費(fèi)者的青睞［9］。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了超聲提取黑豆皮色素的工藝條件，為黑豆皮色素的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1.材料與試劑

黑豆，購(gòu)于山西省金鼎種業(yè)公司。將黑豆浸泡于水中12小時(shí)，手工剝皮，陰干后放置60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，研磨成粉末，60目過(guò)篩后備用。

乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等化學(xué)試劑均為分析純。

KQ—500DE型數(shù)控超聲波清洗器;UV759CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);HHS型恒溫水浴鍋;E438酸度計(jì)。

2.方法與結(jié)果

2.1 黑豆皮色素最大吸收波長(zhǎng)的確定

由于天然色素提取物中存在大量非色素成分，因此，黑豆皮紅色素測(cè)定中，其含量無(wú)法直接表示，故本文用吸光值來(lái)表示［10］。

精確稱取干燥的黑豆皮0.5g，放置于錐形瓶中，按固液比1∶30，加入60%的乙醇15 mL，調(diào)pH至1.5，在60℃、400 W下超聲提取50 min，抽濾或離心得到濾液。取1mL提取液，用蒸餾水稀釋至10 mL，分別在 472 nm、482 nm、492 nm、502 nm、512 nm、522 nm、532 nm、542 nm、552 nm 下測(cè)其吸光值。不同波長(zhǎng)下的吸光值如圖1。由圖可知，黑豆皮色素的吸收峰在波長(zhǎng)為512 nm處。

2.2 單因素試驗(yàn)

圖1 黑豆皮色素最大吸收波長(zhǎng)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)黑豆皮色素的影響

精確稱取干燥的黑豆皮5份，每份0.5 g，按固液比1∶30，分別加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇各15 mL，調(diào)pH至1.5，在60℃、400 W下超聲提取50 min，離心得到濾液。于512 nm下測(cè)定其吸光度考察乙醇濃度對(duì)黑豆皮色素的影響，結(jié)果如圖2:

圖2 乙醇濃度對(duì)黑豆皮色素的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，黑豆皮色素吸光值逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度增至60%時(shí)，其吸光值最大，隨后隨乙醇濃度增加，吸光值呈下降趨勢(shì)。因?yàn)楹诙蛊ど刂谢ㄉ諡橹饕煞?，所以黑豆皮色素呈中等極性。根據(jù)“相似相溶”原理，黑豆皮色素易溶于中等或中等偏上極性的溶劑中。在乙醇溶液中，由于羥基的引入，彼此以氫鍵相連的乙醇分子之間，和水分子也形成氫鍵，降低了水的極性［11］。所以提取劑濃度選為體積分?jǐn)?shù)60%。

2.2.2 固液比對(duì)黑豆皮色素的影響

精確稱取干燥的黑豆皮5份，每份0.5 g，分別按固液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 加入60%的乙醇，調(diào)pH至1.5，在60℃、400 W下超聲提取50 min，離心得到濾液。于512 nm下測(cè)定其吸光度考察固液比對(duì)提取黑豆皮色素的影響，結(jié)果如圖3:

圖3 固液比對(duì)黑豆皮色素的影響

由圖3可知，固液比小于1∶40時(shí)，黑豆皮色素不能被完全提取出來(lái)，隨著固液比進(jìn)一步增加至1∶40時(shí)，吸光值達(dá)到最大，因此，最佳固液比為1∶40。

2.2.3 pH值對(duì)黑豆皮色素的影響

精確稱取干燥的黑豆皮4份，每份0.5 g，按固液比1∶30，加入60%的乙醇15 mL，分別調(diào)pH至0.5、1、1.5、2 四個(gè)梯度，在 60 ℃、400 W 下超聲提取50 min，離心得到濾液。于512 nm下測(cè)定其吸光度考察pH值對(duì)黑豆皮色素的影響，結(jié)果如圖4:

圖4 pH值對(duì)黑豆皮色素的影響

由圖4可知，pH值小于1.5時(shí)，黑豆皮色素吸光值隨著pH值的增加而增大，當(dāng)溶液pH值大于1.5時(shí)，吸光值急劇下降，這是由于pH值的變化改變了色素的結(jié)構(gòu)，因此選溶液pH為1.5為宜。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)黑豆皮色素的影響

精確稱取干燥的黑豆皮5份，每份0.5 g，按固液比1∶30，加入60%的乙醇15mL，調(diào) pH 至1.5，在60℃、400 W下分別超聲提取40 min、50 min、60 min、70 min、80 min，離心得到濾液。于512 nm 下測(cè)定其吸光度考察超聲時(shí)間對(duì)黑豆皮色素的影響。結(jié)果圖5:

圖5 超聲時(shí)間對(duì)提取黑豆皮色素的影響

由圖可知，超聲時(shí)間小于60 min時(shí)，黑豆皮色素提取不完全。當(dāng)超聲時(shí)間大于60 min時(shí)，由于黑豆皮色素會(huì)因時(shí)間的延長(zhǎng)，而逐漸氧化分解，吸光值開(kāi)始下降。因此以60 min為超聲提取時(shí)間。

2.3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合考慮單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù) Box－Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在四因子三水平上對(duì)超聲提取黑豆皮色素的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，因子和水平見(jiàn)表1:

表1 響應(yīng)面分析因子和水平

數(shù)據(jù)處理采用 Design expert 8.0.4軟件，中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及色素吸光值的響應(yīng)值見(jiàn)表2。其中29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和0點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量，取值在由－1，0，1構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，0點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，重復(fù)試驗(yàn)5次，用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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2.3.2 回歸模型的建立及其分析

利用Design Expert 8.0.4軟件，通過(guò)響應(yīng)面回歸方程分析數(shù)據(jù)(分析結(jié)果見(jiàn)表3)，建立吸光度的回歸模型，尋找其最優(yōu)的反應(yīng)條件。根據(jù)參數(shù)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，得到實(shí)驗(yàn)實(shí)際的回歸方程如下:

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果檢驗(yàn)

從表3模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知:實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)實(shí)驗(yàn)擬合良好，模型的P＜0.0001，表明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著。另外，A、B、D、A2、B2、C2、D2影響顯著，交互項(xiàng)均不顯著。失擬項(xiàng)的F值是2.17，其P＞0.05，表明失擬項(xiàng)相對(duì)于純誤差是不顯著的。各交互因素響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖6。

圖6 各因素交互作用的等高線和響應(yīng)面圖

2.3.3 優(yōu)化條件的模型驗(yàn)證

利用Design－Expert8.0.4統(tǒng)計(jì)軟件求解回歸方程得到黑豆皮色素的最佳提取工藝條件為:固液比1∶36.23，乙醇濃度是 55.25%，超聲時(shí)間 62.73 min，pH值為1.41。此時(shí)黑豆皮色素吸光值為0.707。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，同時(shí)考慮到實(shí)際生產(chǎn)操作的便利性，對(duì)得到的最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以固液比1∶36，乙醇濃度是55%，超聲時(shí)間63min，pH值1.4，此時(shí)黑豆皮平均色素吸光值為0.692，與理論值相差較小，因此通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黑豆皮色素的超聲提取工藝條件是可行的，具有實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。

3.結(jié)論

黑豆是一種傳統(tǒng)的黑色食品。黑豆有清除自由基、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、改善睡眠等保健功能。黑豆皮色素作為黑豆中的有效成分是一種理想的天然食用色素［12］。目前有關(guān)黑豆種皮紅色素提取方法主要有鹽酸－乙醇提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法［13］。其中超聲技術(shù)提取天然有效成分具有明顯的優(yōu)勢(shì)，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)大的振動(dòng)、空化效應(yīng)、攪拌作用，可以使活性成分快速溶入溶劑，有效提高萃取率，縮短提取時(shí)間。將黑豆皮色素用超聲波提取法直接從天然植物黑豆皮中浸提，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單合理，提取過(guò)程不使用任何手段或藥劑導(dǎo)致色素產(chǎn)生有害變化。因此，可廣泛用于藥品、化妝品、食品的著色和配料，是一種具有廣闊前景及應(yīng)用價(jià)值的天然色素［14］。

響應(yīng)面分析是一種最優(yōu)化方法，它是將體系的響應(yīng)作為一個(gè)或多個(gè)因素的函數(shù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來(lái)，使人們可以憑直接的觀察來(lái)從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中選擇最優(yōu)化的條件，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析尋找最優(yōu)的工藝參數(shù)［15］。黑豆皮色素提取的最佳工藝條件為:固液比1∶36.23，乙醇濃度是 55.25%，超聲時(shí)間 62.73 min，pH值為1.41。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有些黑豆皮粉末會(huì)沉積在錐型瓶底部，采用磁力攪拌有望提高黑豆皮紅色素的提取效果。

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