姜辣素對小鼠B16細(xì)胞黑素合成的影響*

神芳麗,霍仕霞

(1.新疆銀朵蘭維藥股份有限公司,烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所,新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830049)

姜辣素對小鼠B16細(xì)胞黑素合成的影響*

神芳麗1,霍仕霞2

(1.新疆銀朵蘭維藥股份有限公司,烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所,新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830049)

目的 探討姜辣素對小鼠B16細(xì)胞黑素合成的影響。方法黑素瘤細(xì)胞分別加入12.5,25.0,50.0, 100.0,200.0 μmol·L-1姜辣素和陽性對照藥物氫醌培養(yǎng),達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(DMEM)作為空白對照組。采用四噻唑藍(lán)(MTT)比色法測定細(xì)胞增殖,比色法測定酪氨酸酶活性和黑素含量。結(jié)果與空白對照組比較,含姜辣素的給藥組均能夠明顯抑制小鼠B16細(xì)胞增殖(P＜0.05或P＜0.01),且濃度為200.0 μmol·L-1時(shí),抑制率＞48%。與空白對照組比較,各濃度姜辣素均能夠顯著降低酪氨酸酶活性(P＜0.05或P＜0.01),姜辣素的濃度為200.0 μmol·L-1時(shí),對酪氨酸酶的活性的抑制率可達(dá)50%。與空白對照組比較,各濃度的姜辣素和氫醌均能夠顯著降低黑素含量(P＜0.05或P＜0.01),但不呈劑量依賴性,濃度＞25.0 μmol·L-1時(shí),抑制黑素含量的水平基本無變化。結(jié)論姜辣素能有效抑制黑素細(xì)胞增殖和降低酪氨酸酶活性和黑素含量,從而減少黑素合成。

姜辣素;黑素瘤細(xì)胞;增殖;酪氨酸酶;黑素合成

皮膚色澤是由許多因素互相作用而造成的。皮膚色素大致分兩大類,一類是自身產(chǎn)生的,稱為內(nèi)源性色素;另一類是外來的,稱為外源性色素。由于遺傳、代謝、內(nèi)分泌、營養(yǎng)不良、化學(xué)劑藥物、物理等因素可造成不同程度的色素沉著病,如雀斑、神經(jīng)皮膚黑變病、黃褐斑等,這類疾病的治療也是公認(rèn)的難題。西藥療法存在不良反應(yīng)大、易復(fù)發(fā)等缺陷,而中藥治療有其獨(dú)特的優(yōu)勢。筆者所在課題組在研究治療色素異常等疾病的藥物中,發(fā)現(xiàn)姜辣素有一定的減少皮膚色素、使膚色變白的作用。本研究利用小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)研究的受試細(xì)胞,分別考察姜辣素對細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 姜辣素(主要含6-姜酚,由寶雞宏遠(yuǎn)生物制藥提供,批號:200911024,配制方法:以二甲亞砜溶解,超聲助溶,配制成200 μmol·L-1儲備液,-20℃保存?zhèn)溆?。氫醌(Hydroqiunone,浙江日升昌藥業(yè)有限公司,批號:20111221);達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM,美國Gibco公司,批號:2/2012);胎牛血清(美國Hyclone公司,批號:9/2012),錐蟲藍(lán)、胰酶、TrotonX-100 (scientific research special,批號:06/2012),四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT,America Amresco公司,批號:10/2012]。

1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司,MCO-18AIC型),倒置顯微鏡(中國江南光電,XD-101型),微量振蕩器(江蘇沈高康健生化器具廠,MM-3型),酶標(biāo)儀(美國伯樂公司,BIO-RAD550型),凈化工作臺(中國上海,YJ-875型),立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠,LDZX-75KBS型)。

1.3 細(xì)胞株 B16鼠黑素瘤細(xì)胞,購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 無菌操作,用DMEM培養(yǎng)液分別將姜辣素和陽性對照藥物氫醌配制成不同濃度的稀釋液:12.5,25.0,50.0,100.0,200.0 μmol·L-1。內(nèi)徑0.45 μm微孔濾膜過濾后,低溫、避光儲存。DMEM作為空白對照,每組分別設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞的培養(yǎng) 將細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱培養(yǎng),細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶底80%時(shí),傾去舊培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗滌2次,加入0.25%胰酶0.5 mL,輕輕晃動使胰酶浸潤培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞,倒掉多余胰酶,將培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)箱中,3 min后取出。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞突起收回變圓時(shí),立即加入適量新鮮的完全培養(yǎng)液,吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液,后將細(xì)胞懸液分裝至新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,繼續(xù)培養(yǎng),一般每3～4 d傳代一次,每次實(shí)驗(yàn)取同一代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞增殖率測定 實(shí)驗(yàn)中選擇處于對數(shù)生長期的小鼠B16黑素瘤細(xì)胞,用0.25%胰酶將其消化、吹散,收集并用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度為2×104個(gè)·mL-1,每孔100 μL,接種于96孔培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)。觀察待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液,分別加入含姜辣素和氫醌的培養(yǎng)液200 μL,同時(shí)設(shè)置空白對照孔,加入空白培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后,每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液,每孔加入二甲亞砜溶液150 μL,震蕩10 min后,于490 nm波長處測定吸光度值(A值)。增殖率(%)=加藥組A值/空白對照組A值×100%[1]。

1.7 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性測定 將加入含藥培養(yǎng)液的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液,用PBS洗滌2次,加入1%曲拉通溶液50 μL,-80℃凍存30 min,室溫下融化,37℃預(yù)熱后,每孔加入0.25%左旋多巴溶液10 μL,37℃條件下反應(yīng)2 h,于490 nm波長處測定A值。激活率(%)=加藥組A值/空白對照組A值× 100%[2]。

1.8 黑素含量測定 將加入含藥培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,0.25%胰蛋白酶將其消化、吹散,收集細(xì)胞3 000 r·min-1(r=10 cm)離心10 min,用緩沖液漂洗2次后,加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.5 mL,于37℃下反應(yīng)48 h,充分將細(xì)胞裂解,溶解黑素顆粒。于405 nm波長處測定A值。黑素含量(%)=加藥組A值/空白對照組A值×100%[3]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPASS13.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,測定結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜辣素對小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖的影響 與空白對照組比較,含姜辣素的給藥組均能夠明顯抑制小鼠B16細(xì)胞增殖(P＜0.05或P＜0.01),且濃度為200.0 μmol·L-1時(shí),抑制率＞48%。結(jié)果見表1。

2.2 姜辣素對B16小鼠黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響 與空白對照組比較,各濃度姜辣素均能夠顯著降低酪氨酸酶活性(P＜0.05或P＜0.01),姜辣素的濃度為200.0 μmol·L-1時(shí),對酪氨酸酶的活性的抑制率可達(dá)50%。結(jié)果見表1。

2.3 姜辣素對B16小鼠黑素瘤細(xì)胞黑素含量的影響 與空白對照組比較,各濃度姜辣素和氫醌均能夠顯著降低黑素含量(P＜0.05或P＜0.01),但不呈劑量依賴性,濃度＞25.0 μmol·L-1時(shí),抑制黑素含量的水平基本無變化。結(jié)果見表1。

3 討論

目前,國內(nèi)外研究工作者一般采用不同的黑素細(xì)胞模型進(jìn)行皮膚病的研究,常用的細(xì)胞有正常人黑素細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、永生化黑素細(xì)胞株等。正常培養(yǎng)條件下,體外培養(yǎng)正常黑素細(xì)胞時(shí),細(xì)胞生長速度較為緩慢,若傳代次數(shù)較多,細(xì)胞便會出現(xiàn)衰亡,無法提供滿足實(shí)驗(yàn)所需要的細(xì)胞數(shù)量,因此大大限制正常黑素細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中的研究和臨床上的應(yīng)用。永生化黑素細(xì)胞株和鼠黑素瘤細(xì)胞系已被廣泛應(yīng)用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中,尤其是黑色瘤細(xì)胞株,因其具有產(chǎn)生黑素的功能,而且對實(shí)驗(yàn)條件要求不高,同時(shí)繁殖速度快,生長狀態(tài)較為穩(wěn)定;若能滿足其生長所需的條件時(shí),能夠無限制的繁殖,能夠充分滿足實(shí)驗(yàn)所需,成為研究皮膚病的理想細(xì)胞。因此,本研究采用小鼠B16黑素瘤細(xì)胞株作為體外模型進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)[4-5]。

表1 不同濃度的姜辣素和氫醌對B16黑素瘤小鼠細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影響Tab.1 Effects of different concentration of gingerol and hydroquinone on the proliferation,tyrosinase activity and melanin content in mouse B16 melanoma cell line %,±s

表1 不同濃度的姜辣素和氫醌對B16黑素瘤小鼠細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影響Tab.1 Effects of different concentration of gingerol and hydroquinone on the proliferation,tyrosinase activity and melanin content in mouse B16 melanoma cell line %,±s

與空白對照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with the blank control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

黑素含量空白對照組藥物與濃度/ (μmol·L-1)細(xì)胞增殖率酪氨酸酶激活率100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00氫醌組12.592.76±2.11*190.51±2.69*191.13±0.32*125.087.61±2.14*288.71±2.12*285.02±2.01*250.079.12±1.96*284.32±1.45*280.75±2.21*2100.067.65±3.13*278.76±2.32*273.95±2.78*2200.059.32±1.56*262.09±1.21*265.07±1.28*2姜辣素組12.594.05±2.62*196.88±1.3993.33±1.76*125.092.90±1.07*293.58±1.82*288.15±2.30*250.084.52±1.31*282.71±2.182*282.25±0.59*2100.067.27±1.11*274.14±1.4580.15±2.98*2200.052.31±2.02*250.13±1.3180.67±2.31*2

姜辣素是姜科植物提取物之一,其主要成分有2-姜酚、4-姜酚、6-姜酚和姜烯酚等,也是姜科植物生物活性的主要成分,筆者在本實(shí)驗(yàn)分別考察給藥后B16小鼠黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量,初步從體外研究了姜辣素抑制黑素合成的作用,結(jié)果表明姜辣素能夠顯著抑制B16小鼠黑素瘤細(xì)胞的增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量,表明姜辣素能夠有效抑制黑色素生成,從而起到美白的作用。同時(shí),氫醌作為陽性對照藥,目前廣泛應(yīng)用于外用治療皮膚色素沉著,但其較強(qiáng)的氧化性造成皮膚永久褪色,并引起再生性障礙貧血、致癌等一系列體內(nèi)毒害反應(yīng)[6],而姜辣素可從許多可食用的植物中提取分離得到,毒副作用小,用于治療皮膚色素沉著性皮膚病有很好的應(yīng)用前景。

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[2] 姚莉,尚靖,徐建國.B16細(xì)胞中酪氨酸酶活性測定的方法學(xué)研究[J].新疆中醫(yī)藥,2007,25(4):16-18.

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[5] 楊紅.人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)及過氧化氫對黑素細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2008:12-13.

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.009

Effects of Gingerol on Melanogenesis of B16 Melanoma Cells

SHEN Fang-li1,HUO Shi-xia2
(1.Xinjiang Yinduolan Uighur Medicine Co.,Ltd.,Urmuqi 830049,China;2. Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine,Xinjiang Laboratory of Uighur Medical Prescription,Urmuqi 830049,China)

ObjectiveTo study the effects of the gingerol on the melanogenesis in melanoma B16 cells.MethodsMelanoma cells were cultured with gingerol at 12.5,25.0,50.0,100.0,200.0 μmol·L-1and positive control drug hydroquinone,respectively,using Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM)as the blank control group.The cell proliferation was measured by methyl thiazolyltet tetrazolium(MTT)colorimetric assay.The tyrosinase activity and melanin content were measured by colorimetry assay.ResultsGingerol at different concentrations had inhibitory effect on B16 cell proliferation compared with the blank control group(P＜0.05 orP＜0.01),the inhibition rate being more than 48%at the dosage of 200.0 μmol·L-1.Tyrosinase activity was inhibited significantly compared with blank control group(P＜0.05 orP＜0.01),the inhibition rate being up to 50%at the dosage of 200 μmol·L-1.Melanin content was also decreased at all levels of gingerol compared with blank control group(P＜0.05 orP＜0.01),but not in a dose-dependent manner.The inhibition rate of melanin content reached the plateau at gingerol levels greater than 25.0 μmol·L-1.ConclusionGingerol can inhibit the cell proliferation,tyrosinase activity and decrease melanin synthesis in certain range of concentrations.

Gingerol;Melanoma;Proliferation;Tyrosinase;Melanin

R286;R965

A

1004-0781(2014)10-1291-03

2013-08-01

2013-10-29

*新疆維吾爾自治區(qū)青年基金項(xiàng)目(2012211B59)

神芳麗(1982-),女,山東淄博人,實(shí)習(xí)研究員,學(xué)士,主要從事藥物分析研究。電話:(0)13369610991,E-mail:121769574@qq.com。

霍仕霞(1983-),女,四川鹽亭人,助理研究員,碩士,主要從事藥物分析及中藥藥動學(xué)研究。電話:(0) 13565889322,E-mail:huoshixia1983@163.com。