HPLC法同時(shí)測定水解前后杜仲葉黃酮苷元的含量

王志宏，周云雷，彭勝，鄭陽，史麗娟，彭密軍

(吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室杜仲湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界 427000)

杜仲是我國特有的名貴滋補(bǔ)藥材，具有“三降六抗一增”的功效，引起了人們的廣泛關(guān)注［1］。杜仲含有的活性成分包括黃酮類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類和木脂素等，其中黃酮類物質(zhì)一直是人們研究的熱點(diǎn)，包括其檢測方法、提取工藝以及分離純化等方面［2］。成軍等對杜仲葉提取物進(jìn)行分離純化，經(jīng)波譜法鑒定 5 種化合物為:槲皮素(3，5，7，3'，4'-五羥基黃酮)、山奈酚(3，5，7，4'-四羥基黃酮)、紫云英苷(山奈酚-O-β-D-葡萄糖苷)、異槲皮苷(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷)、蘆丁(槲皮素-3-O-蕓香糖苷)［3］。付桂明采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)杜仲黃酮還包括金絲桃苷(槲皮素-3-半乳糖苷)、槲皮素-3-O-葡萄糖基-(1→2)-阿拉伯糖苷或槲皮素-3-O-木糖基-(1→2)-葡萄糖苷等［4］。研究表明，杜仲中黃酮類物質(zhì)的苷元以槲皮素和山奈酚為主。近年研究發(fā)現(xiàn)，黃酮苷元在人體內(nèi)吸收速度、吸收含量及活性功效方面比黃酮糖苷有明顯的優(yōu)勢［5-7］，其效價(jià)高于黃酮糖苷［8］。通過酸水解可將糖苷鍵原子質(zhì)子化，使糖苷鍵斷裂，成為苷元。

本文建立快速測定杜仲黃酮苷元的檢測方法，并對酸水解前后杜仲黃酮苷元的含量進(jìn)行探討，以期為杜仲黃酮深度開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

槲皮素(批號 YA0806YB13)、山奈酚(批號20130329)，均由上海源葉生物科技有限公司提供，純度≥98%(HPLC);甲醇，色譜純;杜仲葉(采集于吉首大學(xué)張家界校區(qū)實(shí)驗(yàn)基地，經(jīng)吉首大學(xué)廖博儒研究員鑒定為杜仲，60℃烘干，粉碎，過80目篩);杜仲素(杜仲葉提取物，總黃酮含量＞20%)，由張家界恒興生物科技有限公司生產(chǎn)。

LC-20A高效液相色譜儀;U-3900紫外分光光度計(jì);BM400型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋;AEG-220型萬分之一天平;GZX-9146-MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 色譜條件

液相色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.2% 磷酸(63 ∶37)，流速1.0 mL/min，檢測波長370 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

分別精密稱取槲皮素和山奈酚對照品于25 mL棕色容量瓶，用無水甲醇溶解并定容，制成0.1 mg/mL對照品儲備液(4℃貯藏)。取標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行稀釋，配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，槲皮素0.5，1.0，10，20，40，60，80 μg/mL，山奈酚 0.5，1.0，4.0，8.0，12，16，18 μg/mL(4 ℃貯藏)。

1.4 供試溶液的制備

1.4.1 水解前樣品溶液制備 準(zhǔn)確稱取杜仲葉樣品0.5 g于50 mL 燒瓶，以料液比1∶30(g/mL)，溫度70℃，回流提取3次，合并濾液，定容至50 mL。準(zhǔn)確稱取杜仲素20 mg于試管中，加入5 mL無水甲醇，超聲輔助溶解，過濾，定容至10 mL。樣品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行測定。

1.4.2 水解樣品溶液制備 準(zhǔn)確稱取杜仲葉樣品0.5 g于 50 mL三角瓶中，以料液比為 1∶100(g/mL)無水甲醇-鹽酸(4∶1)混合溶液，70℃水解4 h，過濾，定容至 50 mL。適當(dāng)稀釋，經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾，進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取杜仲素樣品20 mg于試管，按上述條件進(jìn)行水解，過濾、定容至10 mL，稀釋，經(jīng) 0.45 μm 濾膜，進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的優(yōu)化 槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外光譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外最大吸收峰Fig.1 The UV absorption peak of standard solution

由圖1可知，槲皮素和山奈酚在254 nm和370 nm處都有吸收峰，但是370 nm處的吸收峰強(qiáng)度更大，峰值較高。所以確定檢測波長為370 nm。

2.1.2 流動相的選擇及優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)及《中國藥典》報(bào)道，同時(shí)測定槲皮素和山奈酚的流動相(有機(jī)相∶水相)比例為50∶50。但在測定過程中，該條件下槲皮素和山奈酚的保留時(shí)間在40 min左右，保留時(shí)間較晚，峰形拖尾。通過考察流動相比例，確定有機(jī)相∶水相為63∶37時(shí)，保留時(shí)間在10 min左右，峰形良好，且與其它物質(zhì)之間的分離效果較好。

由于所測苷元顯弱酸性，加入少量的酸可以適當(dāng)改善拖尾現(xiàn)象，有文獻(xiàn)報(bào)道使用0.4%的磷酸。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)磷酸濃度為0.2%時(shí)，峰形即可達(dá)到同樣的效果，同時(shí)考慮實(shí)驗(yàn)的簡便性及色譜柱耐受pH范圍，所以選擇磷酸濃度為0.2%。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系 對1.3節(jié)配制的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測定，以對照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，見表1。

表1 槲皮素、山奈酚的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(n=3)Table 1 The regression equation，correlation coefficient of references and liner ranges

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一濃度的混合對照品，按照1.2節(jié)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄槲皮素和山奈酚的峰面積。槲皮素和山奈酚的峰面積的RSD分別為1.65%和0.85%。表明儀器的測定精密度較好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品，在0，2，4，10，16，24 h 分別進(jìn)樣，分別記錄槲皮素和山奈酚的峰面積。槲皮素和山奈酚的峰面積的RSD分別為1.73%和0.57%。表明供測樣品在24 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批杜仲葉樣品，每份約為0.5 g左右，按1.4.2節(jié)方法處理，平行 6份，進(jìn)樣20 μL，分別記錄槲皮素和山奈酚的峰面積。槲皮素和山奈酚的峰面積的RSD分別為0.74%和2.00%。表明該方法測定杜仲葉樣品的重復(fù)性較好。

2.2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的杜仲葉供試品9份(槲皮素含量約為2.5 mg/mL，山奈酚含量約為 0.4 mg/mL)，每份約 0.5 g 左右，精確稱量，按照1.4.2節(jié)方法進(jìn)行水解處理，過濾，定容至50 mL。取0.5 mL，再定容至10 mL。分別配制對照品含量為樣品中含量約為80%，100%和120%的混合對照品儲備液，將樣品的溶液與對應(yīng)不同濃度的混合對照品儲備液按1∶1混合，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。

表2 杜仲黃酮苷元加標(biāo)回收率(n=9)Table 2 The recoveries of flavonoid aglycones from Eucommia ulmoides Oliv.

2.3 杜仲及杜仲素黃酮苷元含量的測定

趙德義等通過比較杜仲黃酮和銀杏黃酮的HPLC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)［9］，二者極為相近，并且都含有槲皮素和山奈酚。2010版《中國藥典》已對銀杏黃酮的水解方法有較為詳細(xì)的說明［10］，本文參照《中國藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)［11-13］，對杜仲葉和杜仲素進(jìn)行水解，并比較水解前后苷元含量的變化。高效液相色譜測定黃酮苷元混合溶液對照品以及水解前后黃酮苷元的結(jié)果見圖3，其中1為槲皮素，2為山奈酚。

圖2 對照品與杜仲樣品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of reference substance and samples of Eucommia ulmoides Oliv.

杜仲葉和杜仲素按照同樣的水解工藝進(jìn)行水解，經(jīng)高效液相色譜測定，水解前后杜仲葉以及杜仲素黃酮苷元含量見表3。

由表3可知，杜仲葉本身含有槲皮素與山奈酚，且測定結(jié)果與張欣等測定的結(jié)果基本一致［14］;水解之后的杜仲葉中槲皮素含量提升有20倍之多，山奈酚含量也提升將近16倍，杜仲素在水解之前槲皮素含量就能達(dá)到0.2%，山奈酚可達(dá)到0.04%，水解之后，苷元含量提高將近7倍，水解效果明顯;實(shí)驗(yàn)中按照上述條件，對含量為98%的蘆丁進(jìn)行水解，通過3次平行實(shí)驗(yàn)，水解得率可達(dá)85.68%，證明該方法可水解純度較高的蘆丁，且得率可觀。

3 結(jié)論

建立快速且簡便測定杜仲黃酮苷元的HPLC方法，并對杜仲葉及杜仲素中水解前后黃酮苷元進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，杜仲葉中槲皮素含量為0.021%，而山奈酚則僅含0.005%;通過酸水解，可將苷鍵原子質(zhì)子化，使苷鍵斷裂，杜仲黃酮糖苷變?yōu)檐赵?，所以杜仲葉黃酮苷元含量提高20倍，杜仲素則提高約7倍。

［1］李芳東，杜紅巖.杜仲［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2001.

［2］孫蘭萍，馬龍，張斌，等.杜仲黃酮類化合物的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(3):359-363.

［3］成軍，趙玉英，崔玉新，等.杜仲葉黃酮類化合物研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2000，25(5):284-286.

［4］付桂明，萬茵，張碩，等.杜仲葉總黃酮超臨界提取工藝優(yōu)化及其液質(zhì)聯(lián)用分析［J］.食品科學(xué)，2007，28(12):128-131.

［5］Izumi T，Piskula，Osawas，et al.Soy isoflavone aglycones are absorbed faster and in higher amounts than their glucosides in humans［J］.Journal of Nutrition Education，2000，137(7):1695-1699.

［6］呂鵬，黃曉舞，呂秋軍.黃酮類化合物吸收、分布和代謝的研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2007，32(19):1961-1964.

［7］Crepy V，Morand C，Besson C，et al.Quercetin，butnot its gly-colsides，is absorption from the rat stomach［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(3):618.

［8］Kima H Y，Moonb B H，Lee H J，et al.Flavonol glycosides from the leaves of Eucommia ulomides Oliv.with glycation inhibitory activity［J］.Journal of Ethnopharmacol，2004，93(2):227-230.

［9］趙德義，高錦明，許愛遐，等.杜仲黃酮指紋圖譜研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2003，23(11):1988-1990.

［10］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:296.

［11］伍毅.銀杏黃酮苷元制備的研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2008.

［12］孫勇，林鹿，彭紅，等.微晶纖維素在鹽酸、甲酸體系中的水解動力學(xué)［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36(4):63-65.

［13］陳娟，師彥平.HPLC測定萹蓄中槲皮素和山奈酚的含量［J］.中國中藥雜志，2009，34(4):423-427.

［14］張欣，張春鳳，祁東利，等.HPLC同時(shí)測定杜仲葉中7中成分的含量［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43(5):435-437.