TNF-α對小鼠骨骼肌成肌細胞生理功能的影響

TNF-α對小鼠骨骼肌成肌細胞生理功能的影響

劉文斌1，吳麗姿2， 肖堅1

(1.武漢輕工大學 醫(yī)學技術與護理學院，湖北 武漢 430023；2. 佛羅里達大學 醫(yī)學院，佛羅里達 甘城 FL 32610)

摘要：腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種炎癥相關的細胞因子。通過基因組PCR對Maml1基因敲除和MAML1轉(zhuǎn)基因小鼠進行了鑒定，通過去除血清和增加TNF-α來檢測小鼠骨骼肌成肌細胞的抗饑餓能力。通過分化培養(yǎng)基誘導、TNF或staurosporine處理來研究成肌細胞肌管形成能力。結(jié)果表明，TNF-α促進了成肌細胞抗饑餓的能力，促進成肌細胞分化形成更多、更長、更持久的肌管。同樣，MAML1基因也能夠促進肌管形成。對進一步了解TNF-α對骨骼肌成肌細胞生理功能的影響提供了借鑒。

關鍵詞：腫瘤壞死因子-α；成肌細胞；抗饑餓；細胞分化；肌管

收稿日期：2014-06-11.修回日期：2015-03-23.

作者簡介：劉文斌(1970-)，男，博士，副教授，楚天學子，E-mail:liuwenbin_1@yeah.net.

文章編號：2095-7386(2015)03-0031-06

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.03.007

中圖分類號：Q 2

Effects of TNF-α on murine skeletal muscle myoblasts

LIUWen-bin1，WuLi-zi2，XiaoJian1

( 1. School of Health Science and Nursing，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China；

2. College of Medicine，University of Florida，Gainesville FL 32610，USA)

Abstract：Tumor necrosis factor, TNF, is a kind of cytokine related to inflammation. The genome PCRs were performed to identify the genotypes of Maml1-knock-out and MAML1-transgenic mice. The cellular anti-starvation ability was detected by removing serum and adding TNF-α, and myotube formation ability was detected by exchanging with differentiation medium and adding TNF or staurosporine. The results indicate that TNF-α helps murine skeletal muscle myoblasts the ability of anti-starvation and promotes their differentiation to form more myotubes and keeps them longer and more persistent. MAML1 promotes the differentiation of myoblasts as well. This study helps people to further understand the effects of TNF-α on the physiological functions of myoblasts.

Key words：TNF-α；myoblast；anti-starvation；cell differentiation；myotube

1引言

腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor α，TNF-α)是一種涉及到系統(tǒng)性炎癥的細胞因子，由巨噬細胞分泌，通過與受體的相互作用，調(diào)節(jié)免疫細胞的增殖與分化，最終殺滅腫瘤細胞及入侵的微生物[1]。

TNF-α與肌肉系統(tǒng)的關系表現(xiàn)在其相關信號通路參與了心衰的發(fā)生和進程[2]，并影響了氣道平滑肌細胞的增殖[3]。TNF-α能夠影響骨骼肌細胞中氨基酸的運輸及蛋白的含量[4-5]。激活的TNF-α可以誘導NF-κB的產(chǎn)生，并激活心臟成肌細胞的轉(zhuǎn)錄因子myocardin/SRF的表達，最終促進了心肌肥厚[6]。長期的TNF-α參與的炎癥會引起肌肉組織對胰島素反應減弱[7]。包括TNF-α在內(nèi)的細胞因子對骨骼肌成肌細胞的增殖與分化的影響，人們所知不多[8]。

本文中筆者研究了TNF-α對小鼠骨骼肌成肌細胞的增殖和分化的影響。

2材料與方法

2.1細胞培養(yǎng)及其它試劑

野生型(WT)、Maml1基因敲除(KO)和MAML1轉(zhuǎn)基因(TG)的C57BL/6小鼠系購自美國The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME，USA)。TNF-α和馬血清購自Sigma公司。Staurosporine購自Santa Cruz公司。 F10培養(yǎng)基和bFGF購自Invitrogen公司。DMEM購自Cellgro公司，而胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素購自HyClone公司。

2.2基因鑒定

剪取0.5 cm的4周齡或新生的野生型(WT)、Maml1基因敲除(KO)或MAML1轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠的尾巴，放入含有0.3 mL DNA消化緩沖液(50 mM Tris-HCl，100 mM EDTA，100 mM NaCl和1% SDS，pH 8.0)和2 μL蛋白酶K(20 mg/mL)的Eppendorf管中，用封口膜封住，在50—55 ℃孵育過夜。然后在細胞裂解物中加入1.5 μL RNase H(0.5 mg/mL，不含有DNA酶)，上下顛倒離心管5次，高速離心幾秒，然后放在37 ℃孵育15—60 min。采用常規(guī)的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)方法提取基因組DNA，測量DNA濃度后使用PCR來鑒定MAML1基因。小鼠Maml1基因的PCR上游引物序列為5’GCCACTCCCGCCACCAAAAAC 3’，下游引物序列為5’TTTCCGACCTCATTCTTTACA 3’。人MAML1基因的PCR上游引物(外顯子2)序列為5’CGAGCAGAACTCCCTGTTTC 3’，下游引物(外顯子4)序列為5’CCCTGTGAACTGTCCAACCT 3’?；蛐蚉CR循環(huán)是1 個循環(huán) (96℃ 1 min，62℃ 1 min，72 ℃ 45 s)；加35 個循環(huán) (94 ℃ 50 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s)；72 ℃ 延長5 min，終產(chǎn)物放置室溫。擴增條帶大小為MAML1，415 bp；Maml1，534 bp。

2.3分離和培養(yǎng)新生小鼠骨骼肌成肌細胞

將CO2處理的新生小鼠浸泡在70%的乙醇中，去頭，剪取尾巴用于基因型鑒定。再把鼠身放置磷酸緩沖液(PBS)中，取下四肢，將肌肉與皮膚和骨骼分離。冰上將肌肉剪碎，碎片轉(zhuǎn)移進無菌的1.5 mL Eppendorf管中，加入0.5 mL 0.2% collagenase與0.05% dispase混合液，在37 ℃上下顛倒搖動5 min，去上清。組織碎片轉(zhuǎn)入加有2 mL collagenase/dispase 混合液的15 mL離心管中，封口。在37 ℃上下顛倒搖動10—20 min。組織碎片消化成漿糊狀，使用微量進樣器吸取組織碎片吹打幾次，以破碎團塊。在37 ℃再次上下顛倒搖動5—10 min。將上清液轉(zhuǎn)移入15 mL管中，加入1 mL血清以終止消化。將組織碎片過濾80 μm尼龍網(wǎng)，再次轉(zhuǎn)移至另一個15 mL管中，1 000 r/min 離心5 min。除去上清，使用2—4 mL F10原代成肌細胞生長培養(yǎng)基(80% F10，19% FBS，1% 青霉素和鏈霉素，2.5—5.0 ng/mL bFGF)重懸沉淀，將成肌細胞放置于35—60 mm膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4饑餓實驗及TNF-α處理

將2×105野生型(WT)、Maml1基因敲除(KO)和MAML1轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠的骨骼肌成肌細胞接種于膠原蛋白(collagen)包被的6孔板中，其中含10%FBS的F10培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。待細胞豐度達到80—90%時，除去F10完全培養(yǎng)基，PBS清洗一次，加入無血清的F10培養(yǎng)基，饑餓處理24 h。除去舊的F10培養(yǎng)基，加入含有不同濃度TNF-α(0 ng/mL，20 ng/mL，40 ng/mL)，無血清的F10培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，PBS洗兩次，胰酶消化，用F10培養(yǎng)基重懸細胞，使用血球計數(shù)板在顯微鏡下進行細胞計數(shù)。

2.5成肌細胞分化及TNF-α處理

當小鼠成肌細胞生長到80%豐度時，將生長培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基(95%—98% DMEM，2%—5% 馬血清，1% 青霉素和鏈霉素)。連續(xù)2天更換分化培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)成肌細胞，直至肌管被誘導形成。第三天、第四天、第五天，在分化培養(yǎng)基中添加不同濃度TNF-α(0 ng/mL，1 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL，40 ng/mL)或100 μM促細胞凋亡試劑staurosporine，繼續(xù)培養(yǎng)成肌細胞，觀察肌管形成情況。

2.6肌管數(shù)量及長度計算

當肌管形成時，隨機選擇5個視野拍照，然后計算每個視野中的平均肌管數(shù)量。隨機選擇5個視野拍照，然后量取每根肌管的平均長度，根據(jù)顯微鏡提供的長度標尺計算肌管的實際平均長度。

2.7統(tǒng)計學分析

使用Student’s t 檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，當P≤ 0.05時認為具有統(tǒng)計學差異。數(shù)值表示為平均值 ± 標準方差。

3結(jié)果與分析

3.1基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠中Maml1和MAML1基因的鑒定

如圖1所示，Maml1是小鼠本身的內(nèi)源性基因，在Maml1基因敲除小鼠(KO)的基因組中不能擴增出534 bp Maml1條帶，如小鼠2和4；能擴增出534 bp條帶的是野生型，如小鼠1和3；-指的是陰性對照，不加任何基因組DNA進行PCR擴增，+指的是陽性對照，加入已知Maml1基因DNA進行PCR擴增。M指DNA分子量Marker。在MAML1轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的基因組中能夠擴增出415 bp的條帶，如小鼠6、7、8、9、12，野生型小鼠(WT)是不能擴增出415 bp的條帶的，如小鼠5、10、11，但是能擴增出534 bp條帶，這是內(nèi)源性的Maml1基因條帶；-指的是陰性對照，不加任何基因組DNA進行PCR擴增，+指的是陽性對照，加入已知MAML1基因DNA進行PCR擴增。

3.2TNF-α促進小鼠成肌細胞抗饑餓能力

在小鼠成肌細胞進行饑餓處理(除去或減少胎牛血清供給)2天后，相對于野生型小鼠(WT)而言，Maml1基因敲除(KO)小鼠的成肌細胞存活能力較差，而MAML1轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠的成肌細胞存活能力較強，能達到2倍以上，如圖2所示。Maml1蛋白(小鼠基因產(chǎn)物)或MAML1(人的同源基因產(chǎn)物)蛋白是一個基因轉(zhuǎn)錄共激活因子，它和Notch1或NOTCH1及CSL蛋白形成復合物，在細胞核內(nèi)啟動Notch1或NOTCH1靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，如Cyclin A，Cyclin D1，MAPK，Myc，Bcl-XL等基因，這些基因的表達產(chǎn)物參與細胞的生長和增殖。如果將Maml1基因敲除，必然影響這些靶基因的表達，從而抑制了細胞的生長和分裂，導致成肌細胞存活能力較差，而轉(zhuǎn)入MAML1基因則會增強這些基因的表達，從而增強成肌細胞的存活能力。在加入20 ng/mL TNF-α進行處理后，野生型、基因敲除型和轉(zhuǎn)基因型小鼠的抗饑餓能力都增強。但加入40 ng/mL TNF-α處理的成肌細胞的抗饑餓能力不如20 ng/mL TNF-α處理組，說明更高濃度的TNF-α還是對成肌細胞有傷害的，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學意義，*表示P≤0.05；**表示P≤0.01。

圖2　TNF-α處理的小鼠骨骼肌成肌細胞

3.3TNF-α促進形成更多、更長、更持久的肌管

由于Maml1基因敲除小鼠(KO)的成肌細胞不能分化形成肌管，因此筆者只研究分析野生型(WT)和MAML1轉(zhuǎn)基因型(TG)成肌細胞的分化情況及TNF-α的影響。在誘導分化1天后，成肌細胞開始遷移、融合形成肌管。MAML1轉(zhuǎn)基因型成肌細胞相對于野生型(對照)成肌細胞而言，能夠形成更多、更長的肌管，如圖3所示。每個視野中，野生型成肌細胞形成的肌管平均數(shù)量為11個，平均長度為105 μm；而MAML1轉(zhuǎn)基因型成肌細胞形成的肌管平均數(shù)量為17個，平均長度為160 μm，誘導分化2天后，肌管最長可達580 μm。2天后加入不同濃度TNF-α(0 ng/mL，1 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL，40 ng/mL)或100 μM促細胞凋亡試劑staurosporine，經(jīng)過1天之后，濃度小于20 ng/mL的TNF可以使得成肌細胞產(chǎn)生肌管，但40 ng/mL的TNF有抑制肌管形成的作用。MAML1轉(zhuǎn)基因型成肌細胞相比野生型成肌細胞，能夠形成更多、更長的肌管。加入100 μM staurosporine之后，絕大多數(shù)成肌細胞出現(xiàn)凋亡，即使是已經(jīng)形成的肌管也出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。但MAML1轉(zhuǎn)基因型成肌細胞產(chǎn)生的肌管還有少量殘留，如圖4。4天以后，添加staurosporine的平皿中，成肌細胞基本上都死亡。對于沒有添加staurosporine的平皿，其中的成肌細胞，無論是野生型還是MAML1轉(zhuǎn)基因型，都形成了更多、更長的肌管。1—20 ng/mL的TNF明顯有促進肌管形成的作用，而40 ng/mL的TNF-α則沒有促進作用，甚至有抑制作用。五天后，野生型和MAML1轉(zhuǎn)基因型成肌細胞形成的肌管均出現(xiàn)凋亡和降解，但1—10 ng/mL的TNF-α則有保護作用，經(jīng)過TNF-α處理的較長的肌管能夠存在更長時間。MAML1轉(zhuǎn)基因型成肌細胞形成的肌管保存得更完好一些。有趣的是在實驗中偶然有一次發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過1 ng/mL的TNF-α處理過的MAML1轉(zhuǎn)基因型成肌細胞形成的大肌管(長度超過1 000 μm)居然能夠搏動，象心肌細胞一樣有規(guī)律地跳動。

圖3　誘導分化2天的小鼠骨骼肌成肌細胞

圖4　TNF-α處理誘導分化5天的小鼠骨骼肌成肌細胞

4結(jié)論與討論

人類MAML1基因的mRNA序列有95%和小鼠的Maml1基因同源，其翻譯出的蛋白質(zhì)也是及其相似的，我們嘗試為MAML1和Maml1基因設計了逆轉(zhuǎn)錄PCR的引物，但擴增之后兩者PCR產(chǎn)物的大小和序列是一樣的，因此，在野生型和轉(zhuǎn)基因型小鼠中檢測MAML1和Maml1基因的mRNA是沒有意義的。同時，我們不能使用Western blot檢測到MAML1蛋白，因為其表達量非常低或者在轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉中MAML1基因被修飾抑制了，如甲基化，其它基因的轉(zhuǎn)基因小鼠也經(jīng)常發(fā)生這種修飾。

TNF-α在某些情況下可以促進細胞的死亡，但在另一些條件下則促進細胞的增殖和分化，情況較為復雜[9-11]。針對不同的細胞、組織、器官，TNF-α引起的生理效應也是不一樣的。在用低濃度TNF-α處理的小鼠骨骼肌成肌細胞，其抗饑餓能力非但沒有減弱，反而增強，可能TNF-α通過結(jié)合受體，引起一系列信號通路反應，改變了細胞利用營養(yǎng)物質(zhì)的方法和路徑，減少了對細胞因子(胎牛血清提供)和能量的依賴，從而增加了成肌細胞的存活數(shù)量。但是高濃度TNF-α仍然是激活細胞凋亡信號通路的，因此，TNF-α對細胞生長、分化和死亡的影響是比較復雜的，需要依據(jù)不同細胞，不同實驗條件而定。影響細胞這些生理過程的還有Erk1/2，EGFR，Akt等信號通路，彼此之間有著復雜的聯(lián)系。

促凋亡試劑staurosporine在24 h 內(nèi)就可以誘導成肌細胞凋亡或肌管降解，而低濃度TNF-α沒有誘導成肌細胞或肌管凋亡，卻是誘導形成更多、更長和更持久的肌管。低濃度TNF-α可能通過激活NF-κB或mTOR信號通路而促進了肌管的形成和持久。

因此，TNF-α在小鼠肌肉組織的炎癥反應和再生中可能發(fā)揮重要的作用，其詳細的分子、細胞機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]Croft M. The TNF family in T cell differentiation and function - Unanswered questions and future directions [J].Semin Immunol，2014，pii: S1044-5323(14)00018-9.

[2]Kroetsch J T，Bolz S S. The TNF-α/sphingosine-1-phosphate signaling axis drives myogenic responsiveness in heart failure [J]. J Vasc Res，2013，50(3):177-185.

[3]Khan M A. Inflammation signals airway smooth muscle cell proliferation in asthma pathogenesis [J]. Multidiscip Respir Med，2013，8(1):11.

[4]Tayek J A. Effects of tumor necrosis factor alpha on skeletal muscle amino acid metabolism studied in-vivo [J].J Am Coll Nutr，1996，15(2):164-168.

[5]van Hall G. Cytokines: muscle protein and amino acid metabolism [J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2012，15(1):85-91.

[6]Madonna R，Geng Y J，Bolli R，et al. Co-activation of nuclear factor-κB and myocardin/serum response factor conveys the hypertrophy signal of high insulin levels in cardiac myoblasts [J].J Biol Chem，2014，pii: jbc.M113.540559.

[7]Lee H，Jee Y，Hong K，et al. MicroRNA-494，upregulated by tumor necrosis factor-α，desensitizes insulin effect in C2C12 muscle cells [J]. PLoS One，2013 8(12):e83471.

[8]Ge Y，Waldemer R J，Nalluri R，et al. RNAi screen reveals potentially novel roles of cytokines in myoblast differentiation [J]. PLoS One，2013，8(7):e68068.

[9]Dong C，Wei K J，Zhang W B，et al. LATS2 induced by TNF-alpha and inhibited cell proliferation and invasion by phosphorylating YAP in oral squamous cell carcinoma [J]. J Oral Pathol Med，2015，doi: 10.1111/jop.12317.

[10]Shinohara H，Teramachi J，Okamura H，et al. Double stranded RNA-dependent protein kinase is necessary for TNF-α-induced osteoclast formation in vitro and in vivo [J]. J Cell Biochem，2015，doi: 10.1002/jcb.25151.

[11]Li L，Wang J，Tang L，et al. Coculture with bone marrow stromal cells protects PC12 neuronal cells from tumor necrosis factorαinduced apoptosis by inhibiting the tumor necrosis factor receptor/caspase signaling pathway [J]. Mol Med Rep，2015，doi: 10.3892/mmr.2015.3421.