續(xù)斷菊中楊梅素的LC-MS法測定

許明錄,高明,劉東濤,李倩,李粉

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

續(xù)斷菊（Sonchus asper（L.）Hill）一年兩生草本菊科植物,俗稱花葉滇苦菜.直立高 50~100 cm,下部無毛,中上部及頂端有稀疏腺毛.葉片長橢圓形或倒圓形,長6~15 cm,寬1.5~8 cm,不分裂或羽狀全裂,邊緣有不等的刺狀齒.味苦、性寒,具有清熱解毒、止血的藥用功效；可內(nèi)服也可外用,資源遍布于全國各地,亦可作為野菜食用[1].楊梅素具有降血糖、抗氧化、保護(hù)肝臟、抗血栓、抗心肌缺血、改善微循環(huán)等多方面的藥理作用.續(xù)斷菊是一種常見的具有良好藥用價值的天然植物,對其各種特性的研究國內(nèi)外有很多報道.例如：抗病菌作用[2]、對除草劑的敏感性[3]、對其染色體及核型的研究[4]等.迄今對續(xù)斷菊主要化學(xué)成分的研究文獻(xiàn)也有不少報道,已陸續(xù)從續(xù)斷菊中分離出倍半萜內(nèi)酯苷、紫羅蘭酮衍生物苷[5]；木栓醇乙酸酯,豆甾醇,芹菜素,木犀草素及其7-葡糖醛酸等物質(zhì)[6].并且黃酮類、黃酮醇類、總酚、原花青素等物質(zhì)的含量相對較多；但是皂苷、生物堿類物質(zhì)含量相對較少[7].目前提取天然產(chǎn)物的主要方法有連續(xù)回流提取法、超臨界流體提取法、超聲波提取法、微波提取法等,分離多采用液-液萃取、液液分配柱色譜、膜分離技術(shù)[8]等方法.

本試驗將采集干燥后的續(xù)斷菊采用連續(xù)熱回流提取法、液-液萃取法將其有效成分提取分離出來,經(jīng)HPLC進(jìn)一步純化后LC-MS進(jìn)行定性檢測分析.

1 儀器與試劑

1.1 供試材料和試劑

供試?yán)m(xù)斷菊于2012年10月采自新鄉(xiāng)市河南科技學(xué)院周邊田間,經(jīng)河南科技學(xué)院許桂芳教授鑒定.

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、水為超純水.其他分析純試劑均為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn).

1.2 主要儀器

1.2.1 LC6-AD高效液相色譜儀條件 色譜柱：YMC-Pack Pro,C18 100×4.6mm,S-3μm,12 nm；流動相流速1.0mL/min；波長280 nm；流動相A：超純水用水系濾膜過濾,超聲波震蕩30min除氣泡；流動相B：乙腈（色譜純）用有機系0.22μm過濾薄膜過濾配成83%的溶液（V（乙腈）∶V（水）=83∶17）；進(jìn)樣量10μL.1.2.2 LCQ Deca XPMAX液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件 Surveyor LCPump Plus液相四元泵,帶內(nèi)置真空脫氣機；Surveyor PDA PlusDetector二極管陣列檢測器；電噴霧ESI離子源.

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

將田間采來的續(xù)斷菊自然曬干稱重后,用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇加熱回流提取3次（5 L×3,每次24 h）,合并提取液減壓濃縮蒸干.濃縮物用適量水溶解后,按極性遞增方式依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃?。╒（水）∶V（有機溶劑）=1∶1）,每種有機溶劑重復(fù)3次濃縮蒸干.共得到續(xù)斷菊5個層的提取物質(zhì),取少量乙酸乙酯層提取物,稱重后用甲醇溶解配成5 000 g/L的溶液用于HPLC后續(xù)的分離純化.

2.2 色譜條件優(yōu)化

因此次續(xù)斷菊提取物未上柱處理,所制備的5 000 g/L溶液中含有較多極性不一、相對分子質(zhì)量跨度大的物質(zhì),分離純化較困難.故采用梯度洗脫的方法,對其有效成分進(jìn)行分離.但因所含物質(zhì)較多,探尋一條理想的方法比較困難；前期進(jìn)行一系列的方法探索.

利用前期探索方法,得到較好分離度的餾分較少,還需繼續(xù)優(yōu)化洗脫程序.經(jīng)多次探索后,尋找到一種能得到較好分離度的方法（見表1）.

表1 HPLC梯度洗脫程序Tab.1 HPLC gradient elution program

2.3 物質(zhì)分離純化

利用表1梯度洗脫程序?qū)⑴浜玫娜芤河肏PLC分離純化,進(jìn)樣量10μL.得到5個較好分離度的餾分（見圖1）,在機器重現(xiàn)性好的情況下進(jìn)樣收集,分別編號標(biāo)記.

圖1 HPLC溶液分離純化Fig.1 HPLC solution separation graph

2.4 收集餾分樣品的LC-MS測定

將得到的5個較好餾分稀釋后,在正離子模式下直接進(jìn)樣用LC-MS進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜檢測,進(jìn)樣量2μL,檢測結(jié)果質(zhì)譜圖見圖2.

圖2 LC-MS檢測質(zhì)譜圖Fig.2 LC-MS graph

餾分1的分子式C15H20O8,相對分子質(zhì)量為318,溶于甲醇、乙醇.LC-MS測得餾分1的分子離子峰為[M+H]+319,主要碎片離子為m/z195、m/z125、m/z108,裂解情況如圖3所示.以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道的楊梅素一致,故推斷該化合物為楊梅素.

圖3 楊梅素的結(jié)構(gòu)及其裂解情況Fig.3 Structure and decomposition of myricetin

3 結(jié)論

因提取物未上柱,其中所含有較多結(jié)構(gòu)不同、極性不一的物質(zhì).分離時需采用梯度洗脫程序,這樣能夠收集到更多的純餾分.餾分進(jìn)行LC-MS檢測,與查閱的關(guān)于楊梅素的結(jié)構(gòu)特點相比較,本文通過LC-MS聯(lián)用儀測得的餾分1和楊梅素結(jié)構(gòu)相吻合,故鑒定出餾分1為楊梅素；其他餾分因?qū)嶒灧椒ㄎ茨芏ㄐ猿銎錅?zhǔn)確結(jié)構(gòu).本研究一方面從化學(xué)成分層面上,了解續(xù)斷菊的主要化學(xué)成分有助于客觀地評價其藥用價值；另一方面,通過對續(xù)斷菊提取物進(jìn)行分離,可以為其進(jìn)一步的分離提供有效的可參考的實驗方法,也為續(xù)斷菊的研究開發(fā)和新藥的研究奠定了基礎(chǔ).

[1]高向陽,張娜,史可夫.不同生長期續(xù)斷菊中氨基酸柱前衍生RP-HPLC同時測定及營養(yǎng)特性比較[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013（12）：111-114.

[2]許桂芳,王鴻升,劉明久.外來植物續(xù)斷菊的化感作用研究[J].河南師范大學(xué)學(xué)報,2011,39（5）：141-144.

[3]張媛媛,羅小勇.三十五種菊科植物對吡氟禾草靈的敏感性差異[J].植物保護(hù)學(xué)報,2010,37（6）：557-561.

[4]楊得奎,李法曾,周俊英,等.續(xù)斷菊的染色體研究[J].山東師大學(xué)報,1995,10（4）：429-431.

[5]Shimizu S,Miyase T,Ueno A,et al.Sesquiterpene lactone glycosides and ionone derivative glycosides from Sonchus asper[J].Phytochemistry,1989,28（12）：3399-3402.

[6]沈珊梅.續(xù)斷菊的化學(xué)成分[J].國外醫(yī)學(xué)：藥學(xué)分冊,1980（2）：121.

[7]Jimoh FO,Adedapo A A,Afolayan A J.Comparison of the nutritive value,antioxidant and antibacterial activities of Sonchus asper and Sonchus oleraceus[J].Records of Natural Products,2011,5（1）：29-42.

[8]王姣,姜忠義,吳洪,等.中藥有效成分和有效部位分離用膜[J].中國中藥雜志,2005,30（3）：165-170.

[9]張元媛,賈曉妮,曹永翔,等.黃蜀葵花化學(xué)成分研究[J].西北藥學(xué)雜志,2008,23（2）：80-82.