動物隱花色素研究進展

呂垣澄，吳曉暉

復旦大學生命科學學院，遺傳工程國家重點實驗室及發(fā)育與疾病國際聯(lián)合研究中心，遺傳與發(fā)育協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200433

隱花色素(Cryptochromes)是一類在高等真核生物中廣泛存在的、對藍光和近紫外光敏感的黃素類蛋白，也稱紫外光-A/藍光受體(UV-A/blue-light receptor)。隱花色素因其有助于孢子繁殖的隱花植物吸收藍光而得名，植物隱花色素主要在植物光形態(tài)建成、開花調控、生物鐘調控及氣孔開放和感知磁場中發(fā)揮作用[1]。1993年擬南芥隱花色素基因cry1(又名hy4)首先被克隆[2]，1996年起，黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)等動物的隱花色素基因也陸續(xù)被克隆。與植物隱花色素不同，動物的隱花色素主要在動物生物鐘調控、免疫應答、糖類代謝以及感知磁場等過程中發(fā)揮作用。本文將對動物隱花色素的克隆與表達、結構特征、生理功能和作用機制進行綜述。

1 動物隱花色素的克隆與表達

隱花色素在多種動物中廣泛存在。無脊椎動物中，果蠅的隱花色素基因dCry克隆于1996年[3]。2005年，帝王斑蝶(Danaus plexippus)的隱花色素基因dpCry1和dpCry2也被發(fā)現(xiàn)[4]。目前發(fā)現(xiàn)，果蠅之外的絕大部分昆蟲都有不止一個隱花色素基因[5]。哺乳動物一般具有兩個隱花色素基因，其中人的隱花色素基因hCry1和 hCry2克隆于1996年[3,6]。兩年后，小鼠隱花色素基因mCry1和mCry2也被克隆[7]。此后，非哺乳類脊椎動物的隱花色素基因也被陸續(xù)克隆，目前已知非洲爪蟾(Xenopus laevis)具有XtCry1、XtCry2和 XtCry43個隱花色素基因[8]，雞(Gallus gallus domesticus)具有cCry1、cCry2和cCry43個隱花色素基因[9]。斑馬魚(Danio rerio)則具有 zCry1a、zCry1b、zCry2a、zCry2b、zCry3和 zCry46個隱花色素基因[10]。

動物隱花色素常高表達于神經(jīng)組織。果蠅dCRY高表達在腹側神經(jīng)元[11](Ventral lateral neurons,LNvs)及復眼感光細胞[12]，主要定位于細胞質。小鼠mCRY1高表達于視交叉上核(Suprachiasmatic nucleus,SCN)，定位于線粒體；mCRY2高表達于視網(wǎng)膜，定位于細胞核[7]。人hCRY2高表達于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層(Ganglion cell layer，GCL)，定位于細胞核和細胞質[13]。

2 動物隱花色素的結構特征

動物隱花色素蛋白包含N端的光修復酶同源區(qū)(Photolyase homology region，PHR)以及序列和長度不保守的 C端調控尾區(qū)(C-terminal regulatory tail region)。前者缺乏光修復酶的DNA損傷修復功能，后者與蛋白細胞內定位有關[3]。2011年，Zoltowski等[14,15]解析了果蠅隱花色素蛋白dCRY的結構。PHR區(qū)的三維結構包含N端的α/β結構域和C端的螺旋結構域，兩個結構域間是一個長的聯(lián)結。螺旋結構域的兩個凸角形成一個腔，可以非共價結合黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)。PHR區(qū)凹槽處的催化中心不結合 DNA底物，而是結合C端調控尾上第536位上保守的色氨酸(Trp536)突出，從而模擬光修復酶對DNA光化產(chǎn)物的識別。dCRY上的Trp 342、Trp 397和Trp 4203個氨基酸組成的光活化電子傳遞鏈接受光能后，能將結合的氧化態(tài) FAD(FADox)轉變?yōu)殡p電子還原態(tài) FAD(FAD?-)。這一光致還原過程會引發(fā)dCRY構象改變，導致C端調控尾離開PHR區(qū)的凹槽。2013年，Czarna等[16]又解析了小鼠隱花色素蛋白 mCRY1的結構，mCRY1與dCRY在個別氨基酸上的差異賦予mCRY1一些不同的特性。如mCRY1的Ser71、Ser280是腺苷酸活化蛋白激酶AMPK的磷酸化位點，可以響應細胞的代謝狀態(tài)而調控 mCRY1的穩(wěn)定性；Ser247是絲裂原活化蛋白激酶MAPK的磷酸化位點，影響mCRY1作為轉錄抑制物的活性。

3 動物隱花色素調控生物鐘的功能與作用機制

生物鐘是生物體行為、生理和代謝活動廣泛存在的晝夜節(jié)律。動物生物鐘的形成和維持依靠轉錄/翻譯負反饋環(huán)路中的轉錄激活物和抑制物，它們使體內生物鐘蛋白以及鐘控蛋白的含量晝夜變化。隱花色素參與了生物鐘的形成。根據(jù)隱花色素在調控生物鐘中的作用，它們被分為兩類(圖 1)。I型隱花色素(如果蠅dCRY)是無轉錄抑制作用，作為光受體對光響應的隱花色素。II型隱花色素(如小鼠和人的CRY)作為轉錄抑制物，對光無依賴。有意思的是，帝王斑蝶既具有類似dCRY的I型光依賴但無抑制作用的隱花色素dpCRY1，也具有類似mCRY1/2的II型有抑制作用但無光依賴的隱花色素 dpCRY2[4]。斑馬魚中，zCRY3和zCRY4是類似dCRY的I型隱花色素，zCRY1a、zCRY1b、zCRY2a和zCRY2b是類似mCRY1/2的II型隱花色素[10]。

dCRY是果蠅生物鐘轉錄/翻譯負反饋環(huán)路的一部分，參與對光響應和生物鐘調控。在黑暗狀態(tài)下，dCRY的 C端尾嵌入 PHR區(qū)的凹槽，阻止其與Timless蛋白及E3泛素連接酶JETLAG (JET) 相結合[14,17]。此時，轉錄因子CLOCK和CYCLE激活攜帶E-box啟動子元件的基因period (per)、timless (tim)以及cry表達[18]。PER蛋白與TIM蛋白相結合形成復合物，磷酸化后進入核內抑制CLOCK和CYCLE的功能，從而保持PER與TIM的含量穩(wěn)定在較低水平。在光照下，dCRY蛋白PHR區(qū)結合的FAD被光致還原引發(fā) dCRY構象改變，暴露出的 PHR區(qū)與TIM及JET結合。JET的泛素化作用導致dCRY和TIM降解，從而解除 PER與 TIM對 CLOCK和CYCLE的抑制，促進per和tim表達。野生型果蠅在夜間被光刺激后，會表現(xiàn)出時相位移。而具有FAD結合位點突變的 cryb果蠅即使給予正常明暗周期，其PER和TIM蛋白的表達也發(fā)生紊亂[19]。

小鼠等哺乳動物的CRY1和CRY2屬于充當轉錄抑制物的II型隱花色素。小鼠視交叉上核CRY1的表達呈現(xiàn)晝夜節(jié)律，在連續(xù)黑暗中也能保持。野生型小鼠在連續(xù)黑暗中能保持與在正常光暗周期下相同的約 24 h的自主活動周期，不受光照影響。mCry1或mCry2敲除小鼠在正常光暗周期下能維持約24 h的自主活動周期，但在連續(xù)黑暗中分別展現(xiàn)加速和減緩的周期性自主活動[20]。小鼠自主的節(jié)律性活動不僅依靠mCRY1和mCRY2，也受到光受體(視黑素)傳遞的光信號調節(jié)[21]。mCry1和 mCry2雙敲除的小鼠，在連續(xù)黑暗下完全丟失自主活動節(jié)律，但在正常光暗周期下仍能維持約24 h的自主活動周期[20]。在夜里給予雙敲除小鼠光誘導，能使Per表達上調形成類似于生物鐘的相移[22]。

哺乳動物生物鐘也依賴于內在的轉錄/翻譯負反饋環(huán)路(圖 1)。在生物鐘周期的起始，轉錄因子CLOCK-BMAL1異源二聚體激活啟動子區(qū)含E盒增強子的基因 Cry1、Cry2、Per1、Per2、Per3、Rev-erbα和Rev-erbβ等表達。產(chǎn)生的各種CRY與PER蛋白在細胞質中結合并入核。一段時間后，隨著上述蛋白在細胞核內濃度的增加，CRY蛋白發(fā)揮轉錄抑制功能，阻遏CLOCK和BMAL1介導的轉錄。另一方面，表達出的REV蛋白入核并與促進Bmal1基因轉錄的ROR蛋白競爭性結合Bmal1啟動子中的RORE響應元件，從而阻遏Bmal1的轉錄[23]。這些事件導致CLOCK-BMAL1異源二聚體濃度降低，轉錄激活水平進一步下降。隨后，新一輪生物鐘周期又隨著核內CRY、PER和 REV等蛋白表達下降和降解，CLOCK-BMAL1異源二聚體所受阻遏的解除而逐漸啟動[24]。

圖1 兩種類型隱花色素的轉錄/翻譯反饋循環(huán)的示意圖

除了轉錄/翻譯負反饋循環(huán)路，磷酸化、泛素化、乙?；?、Sumo化等翻譯后修飾對于調控生物鐘蛋白的穩(wěn)定性及細胞亞定位也起著重要作用。以CRY蛋白為例，屬于F盒型E3泛素連接酶家族的FBXL3在核內結合CRY并誘導其泛素化降解[25,26]。同一家族的FBXL21則主要在細胞質中結合CRY保持其穩(wěn)定[27]。另外，CRY1的Ser 247和CRY2的Ser 265位點一樣都可被激酶 MAPK磷酸化，增強自身對CLOCK-BMAL1異源二聚體的阻遏活性，但CRY2的C端比CRY1多一個可被激酶DYRK1A磷酸化的Ser 557位點[28]。該位點磷酸化伴隨著糖原合成酶激酶GSK-3β介導的Ser 553位點磷酸化，最終誘導CRY2自身被蛋白酶體降解[29]，這使 CRY2對 CLOCKBMAL1異源二聚體的阻遏效果弱于 CRY1。這樣，在CRY1和CRY2核內蛋白總量相對恒定時，其比例將可以雙向調控生物鐘周期[30]。這與 Cry1和 Cry2基因敲除小鼠分別展現(xiàn)加速和減緩的周期性自主活動相吻合[20]。

隱花色素也是生物鐘與糖類代謝和免疫應答聯(lián)系的中心分子。小鼠CRY1和CRY2作用于糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptor)后，抑制糖皮質激素受體參與的轉錄[31]。CRY1和CRY2結合小分子KL001后，避免自身被泛素化降解，CRY1量增多，CRY2量則維持穩(wěn)定，在減緩生物鐘的同時抑制胰高血糖素誘導的糖異生作用[30]。而缺少了CRY1和CRY2，細胞 NF-κB和 PKA信號通路會被激活，前炎癥細胞因子的水平提升[32]。

4 動物隱花色素在磁場感知中的作用和可能機制

磁場感知(Magnetoreception)是指生物利用地磁場為歸航、筑巢及長距離遷徙等行動提供方位信息的能力。昆蟲、魚類、鳥類和哺乳動物的許多物種都有磁場感知能力。例如，Canton-S品系果蠅未受訓練時在測試裝置中趨向于無磁場的一側；通過訓練建立起食物與磁場間的條件反射后則可趨向有磁場的一側[33](圖2)。紅鮭魚(Oncorhynchus nerka)洄游的方向不受光照影響，但當磁場方向逆時針偏轉90度后其游動方向也相應逆時針偏轉近 90度[34]。鴿(Columba livia)可以在沒有太陽指向的陰天正確歸航，但頸背部粘上磁鐵后會在陰天迷失方向[35]。C57BL/6J品系小鼠經(jīng)過訓練后可將窩搭在特定的磁場方向上[36]，野牛(Bos primigenius)、馬鹿(Cervus elaphus)、西方狍(Capreolus capreolus)吃草和休息時的體軸指向也依地磁場方向調整[37]。

研究發(fā)現(xiàn)隱花色素和近紫外光的存在是果蠅感知磁場能力的必要條件[33]。缺乏400～420 nm波長近紫外光時，Canton-S果蠅無法鑒別磁場。cry基因缺陷(cryb)或缺失(cry0)的 Canton-S果蠅無論是否接受訓練也都不能在測試裝置中展現(xiàn)磁場趨向性。但體內表達帝王斑蝶的 dpCry1或 dpCry2基因后，cryb突變果蠅可在波長420 nm以下光照射時感知磁場[38]。表達人 hCry2轉基因后，cryb突變果蠅也可在400～500 nm近紫外光和藍光照射下恢復磁場感知[39]。有意思的是，上述波長正處于相應隱花色素的敏感波段，提示光照可能是通過隱花色素發(fā)揮作用[40,41]。

遷徙鳥類的磁場感知也可能與隱花色素相聯(lián)系[42]。處于強度較低的短波長單色光(370 nm紫外光，424 nm藍光，502 nm藍綠光或565 nm綠光)中時，知更鳥(Erithacus rubecula)的春季遷徙方向保持正常。處于其隱花色素不敏感的長波長黃光或紅光中時，知更鳥會迷失方向[43]。花園鶯(Sylvia borin)感受磁場變化后其神經(jīng)節(jié)細胞活躍，而其視網(wǎng)膜和神經(jīng)節(jié)細胞中均有豐富的 CRY1蛋白分布，與此相反，非遷徙鳥類的神經(jīng)節(jié)細胞在感受磁場變化后不活躍，細胞中CRY1含量也很低[44,45]。

圖2 果蠅感知磁場的行為檢測原理圖

長期以來，解釋動物磁場感知機理的主要有磁晶體感知(Magnetite-based magnetoreception)和化學磁感知(Chemical magnetoreception)兩種假說[46]。磁晶體感知假說認為在外部磁場作用下，細胞中的磁晶體顆粒簇陣列將發(fā)生形變，影響細胞膜上離子通道的開放，產(chǎn)生相應的細胞膜電位，幫助動物感知磁場。鴿、知更鳥等上喙部都有磁晶體存在，產(chǎn)生的信號可能通過三叉神經(jīng)傳遞至腦[47]。鮭魚的嗅瓣也被發(fā)現(xiàn)具有磁晶體[46]。然而，很多有磁感知能力的動物體內未發(fā)現(xiàn)磁晶體或與磁晶體相聯(lián)系的神經(jīng)通路。知更鳥暴露于地磁場強度1%的微弱高頻振蕩磁場中也會失去對春季遷徙方向的偏好[48]。這些都暗示存在磁晶體感知外的其他磁感知機制。

化學磁感知假說認為，動物細胞內某些磁感受器具有對磁場敏感的自由基對(Radical pair)，可以接受能量發(fā)生電子躍遷。若電子在躍遷過程中自旋方向不變化，自由基對處于單重態(tài)。一旦磁場造成電子自旋方向的變化，產(chǎn)生自旋不配對的電子，自由基對便會處于三重態(tài)。不同的磁場方向和強度改變自由基對處于單重態(tài)和三重態(tài)的比率和轉換的頻率，產(chǎn)生不同的磁場信號傳輸?shù)缴窠?jīng)系統(tǒng)，參與動物對磁場的感知。由于電子自旋狀態(tài)的共振效應，自由基對對于磁場的響應會比磁晶體更敏感，這可能是微弱人工磁場能干擾動物磁感知能力的原因[48]。同時，電子躍遷所需能量可由光引發(fā)的電子傳遞來提供。因此，隱花色素等細胞內的光受體視為可能的磁受體[46]。果蠅dCRY在光刺激下能與一個參與視覺信號通路的蛋白復合物 Signalplex結合[49]，這種結合靠dCRY的C端尾與腳手架蛋白INAD (Inactivation No-After potential D)的相互作用介導。這可能是 dCRY調節(jié)腹側神經(jīng)元細胞膜興奮性及發(fā)放頻率的基礎[50]?？紤]到隱花色素存在于絕大部分無脊椎動物和脊椎動物，化學磁感知可能是動物中更普遍的磁感知機制。

解釋化學磁感知分子機制最常用的是[FADH?+Trp?]假說。這一觀點認為，隱花色素蛋白結合的FAD輔基受到光子撞擊后會接受一個質子并從最鄰近的色氨酸殘基(Trp)上奪得一個電子，形成[FADH?+Trp?]自由基對充當磁敏自由基對[51]。但是這一假說近年來受到果蠅實驗結果的挑戰(zhàn)。雖然帝王斑蝶dpCry2上FAD相鄰345位色氨酸突變成苯丙氨酸后不能再幫助cryb果蠅感知磁場[38]，但在cryb果蠅中表達FAD相鄰342位色氨酸突變成苯丙氨酸的果蠅dCry基因，或FAD相鄰328位色氨酸突變成苯丙氨酸的帝王斑蝶 dpCry1基因都能使其恢復磁場感知。在體外實驗中，上述突變能阻礙[FADH?+ Trp?]自由基對形成所需的光致還原過程[38]。對此，也有人提出隱花色素可能通過[FADH?+ O2?-]自由基對充當磁敏自由基對[52]。這一觀點的主要實驗證據(jù)是擬南芥隱花色素AtCRY1在FADH?回到氧化態(tài)的過程需要超氧化物的參與，因此可能形成[FADH?+ O2?-]自由基對[53]。考慮到人視網(wǎng)膜富含隱花色素而超氧化物缺乏，這一假說也可用于解釋人為何不能感知磁場[52]。但總體而言，[FADH?+ O2?-]假說還需要動物體內的直接實驗證據(jù)支持。

目前沒有證據(jù)表明隱花色素在磁場感知和生物鐘調節(jié)過程中使用了相似的分子機理。dCRY感知磁場不受PER、TIM和CYCLE等生物鐘蛋白缺陷的影響，tim或cycle基因敲除的果蠅具有正常感知磁場能力[38]。通過連續(xù)光照造成果蠅生物鐘紊亂時，dCRY處于低水平，其他生物鐘蛋白無法積累，但磁感知能力不受影響[33]。

5 結語與展望

隱花色素在動物中廣泛存在，對其基本結構及分子作用機制等已經(jīng)有了較多的研究，但對其生理作用機制和在疾病中的影響仍有待進一步探索。在生理作用機制方面，隱花色素是目前動物中已知的唯一直接參與磁場感知的蛋白，但如何參與仍不明確。例如，II型隱花色素作為轉錄抑制物調控生物鐘時不依賴光，為何卻在果蠅中參與感知磁場時接受光誘導?人的隱花色素在果蠅具有感知磁場功能，但人卻不能像果蠅一樣感知磁場。進化是否抹去了隱花色素感知磁場的必要條件，這些條件究竟是什么? 了解隱花色素磁敏自由基對組成和磁場信號傳遞的神經(jīng)通路有望對此做出回答。在疾病影響方面，隱花色素參與生物鐘維持機體生命活動的基本節(jié)律。生物鐘紊亂不僅可以影響思維和免疫，而且與肥胖、糖尿病等代謝疾病和心血管疾病密切相關。哺乳動物隱花色素CRY1和CRY2可雙向調控生物鐘周期，通過調控 CRY1和CRY2的比例可能有望用于糾正生物鐘紊亂和各種相關疾病。目前，已有研究人員根據(jù)這一思路尋找調控隱花色素蛋白活性的小分子化合物[30]。總之，隱花色素研究具有重要的理論意義和應用價值。綜合利用神經(jīng)生物學、模式動物遺傳學、分子細胞生物學等手段開展工作，解析隱花色素相關信號和生理通路，將有望揭開動物隱花色素的神秘面紗。

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