山鷓鴣屬鳥類線粒體基因組的比較及系統(tǒng)發(fā)育研究

李雪娟，黃原，雷富民

1. 陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710062；

2. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

山鷓鴣屬鳥類線粒體基因組的比較及系統(tǒng)發(fā)育研究

李雪娟1，黃原1，雷富民2

1. 陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710062；

2. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

海南山鷓鴣(Arborophila ardens)對(duì)生境選擇比較嚴(yán)格，種群數(shù)量稀少，屬于瀕危物種。為進(jìn)一步研究山鷓鴣屬的進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，文章利用Illumina Hiseq2000高通量測(cè)序技術(shù)獲得了海南山鷓鴣線粒體全基因組序列，從比較基因組學(xué)角度分析了4種山鷓鴣鳥類的線粒體基因組特征，并探討了山鷓鴣屬鳥類的系統(tǒng)發(fā)育地位。研究結(jié)果表明：(1) 海南山鷓鴣線粒體基因組長(zhǎng)度為16 730 bp，編碼13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)核糖體RNA基因、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因以及1個(gè)控制區(qū)；(2) 山鷓鴣屬物種受到了純化選擇的作用，且在進(jìn)化過(guò)程中積累了更多的非同義替換；(3) 山鷓鴣屬位于雉科鳥類系統(tǒng)樹的基部位置，其中白眉山鷓鴣與紅喉山鷓鴣互為姐妹群，海南山鷓鴣位于山鷓鴣屬的基部位置，與其他3種山鷓鴣鳥類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

海南山鷓鴣；線粒體基因組；比較基因組學(xué)；系統(tǒng)發(fā)育

山鷓鴣屬(Arborophila)鳥類隸屬雞形目(Galliformes)、雉科(Phasianidae)[1]，分布于我國(guó)西藏、四川、云南、廣西、廣東、福建、海南和臺(tái)灣等地，國(guó)外見(jiàn)于印度、緬甸、泰國(guó)及東南亞地區(qū)。山鷓鴣屬鳥類全世界共有 18種，其中 10種分布于我國(guó)，4種為我國(guó)特有種。海南山鷓鴣(Arborophila ardens)是我國(guó)的特有種，僅分布于海南島，生活環(huán)境與白鷴(Lophura nycthemera whiteheadi)及灰孔雀雉(Polyplectron bicalcaratum katsumatae)相似[2]。海南山鷓鴣對(duì)生境選擇比較嚴(yán)格，主要棲息于海南熱帶雨林和山地常綠林[2]，包括尖峰嶺、霸王嶺、五指山和吊羅山等地[3]。該物種種群數(shù)量稀少，目前已處于瀕危狀態(tài)[2]，是國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，被列入中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書[4]和世界瀕危鳥類紅皮書[5]。國(guó)際自然保護(hù)同盟(IUCN)物種生存委員會(huì)(SSC)把海南山鷓鴣列入2000～2004年的保護(hù)行動(dòng)計(jì)劃，并建議作為海南物種保護(hù)的“旗艦種”[6]。

迄今為止，人們對(duì)于海南山鷓鴣的研究還僅局限于換羽[7]、活動(dòng)區(qū)和生境利用[8,9]等方面。為深入研究山鷓鴣屬物種的進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究測(cè)定了海南山鷓鴣(A. ardens)線粒體全基因組序列，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公開的另外3種山鷓鴣屬鳥類的線粒體基因組序列——白眉山鷓鴣(A. gingica, FJ752425)、紅喉山鷓鴣(A. rufogularis, FJ752424)、四川山鷓鴣(A. rufipectus, FJ194942)，對(duì)山鷓鴣屬鳥類線粒體基因組序列的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了比較分析，并聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的線粒體基因組序列構(gòu)建了雉科鳥類的系統(tǒng)發(fā)育樹，探討了山鷓鴣屬鳥類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

海南山鷓鴣標(biāo)本于2008年采自海南島，浸泡于無(wú)水乙醇中，并保存于-20℃冰箱。相關(guān)憑證標(biāo)本現(xiàn)保存于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鳥類標(biāo)本館。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

采用傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇抽提法提取總DNA[10]。參考Sorenson等[11]提供的引物位置和序列，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)雞形目鳥類的線粒體基因組序列，本研究最終確定了10對(duì)PCR擴(kuò)增引物，并且使用Oligo 6.0軟件對(duì)引物進(jìn)行了評(píng)價(jià)(附表1)。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?3℃預(yù)變性2 min；92℃變性10 s，58～53℃復(fù)性30 s，68℃延伸10 min，共20個(gè)循環(huán)；92℃變性10 s，53℃復(fù)性30 s，68℃延伸10 min，且延伸步驟每個(gè)循環(huán)增加20 s，共20個(gè)循環(huán)；68℃終延伸7 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增體系為15 μL，包括: 10×LA PCR Buffer 1.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2.4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2.1 μL，LA TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.18 μL，總DNA(模板)1～2 μL，然后加ddH2O補(bǔ)足。

等濃度混合純化所得質(zhì)量較好的片段，構(gòu)建約500 bp的測(cè)序文庫(kù)，采用Illumina Hiseq2000進(jìn)行雙末端測(cè)序，reads長(zhǎng)度為100 bp。拼接過(guò)程中產(chǎn)生的缺口(gap)使用Sorenson等[11]提供的鄰近引物以Sanger測(cè)序法補(bǔ)全(附表1中的補(bǔ)充引物)。測(cè)序工作由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.2.2 序列拼接和注釋

海南山鷓鴣線粒體基因組序列采用 SOAP-denovo軟件進(jìn)行拼接。線粒體基因組序列用在線軟件 tRNAscan-SE1.21[12]預(yù)測(cè) tRNA基因的位置及二級(jí)結(jié)構(gòu)，必要時(shí)需根據(jù)典型三葉草形結(jié)構(gòu)特點(diǎn)輔以人工校正，最終得到了除 tRNAVal和 tRNASer(AGY)基因之外20個(gè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。參考其他已發(fā)表的山鷓鴣屬物種線粒體基因組注釋信息，本研究進(jìn)而確定tRNAVal和tRNASer(AGY)基因、蛋白質(zhì)編碼基因、rRNA基因及 CR的位置。參考 RNA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rna.ccbb.utexas.edu/)中紅原雞(Gallus gallus)、綠頭鴨(Anas platyrhynchos)和非洲爪蟾(Xenopus laevis)，以及地山雀(Pseudopodoces humilis)[13]、黑尾地鴉(Podoces hendersoni)[14]和黃牛(Bos taurus)[15]的 rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)海南山鷓鴣 12S和16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用MEGA4.1[16]軟件分析線粒體基因組核苷酸組成、蛋白質(zhì)編碼基因氨基酸組成等信息。

1.2.3 同義替換率和非同義替換率

本研究將4種山鷓鴣屬物種分為6組：海南山鷓鴣-白眉山鷓鴣、海南山鷓鴣-紅喉山鷓鴣、海南山鷓鴣-四川山鷓鴣、紅喉山鷓鴣-白眉山鷓鴣、紅喉山鷓鴣-四川山鷓鴣以及白眉山鷓鴣-四川山鷓鴣，利用 Kaks_calculator2.0軟件分別計(jì)算 13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的同義替換率(Synonymous substitution rate, Ks)、非同義替換率(Nonsynonymous substitution rate, Ka)以及非同義替換率與同義替換率的比值(Ka/Ks)[17]。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

結(jié)合從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的數(shù)據(jù)，本研究共選取雉科7亞科21屬24個(gè)物種及1個(gè)外群(Alectura lathami, NC_007227)的線粒體基因組序列，從線粒體基因組水平探討了山鷓鴣屬鳥類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。將比對(duì)好的單個(gè)線粒體基因連接成一個(gè)聯(lián)合數(shù)據(jù)集(mitogenome, PCGs+rRNAs+tRNAs+CR)，分別采用最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony, MP)、最大似然法(Maximum likelihood, ML)及貝葉斯推論法(Bayesian inference, BI)構(gòu)建系統(tǒng)樹。利用軟件MrModelTest 2.2為聯(lián)合數(shù)據(jù)集選擇最優(yōu)模型。利用PAUP*4.0 b10軟件以啟發(fā)式搜索構(gòu)建 MP樹(自舉 1000次)；利用RAxML 7.0.3軟件以最優(yōu)模型(GTR+I+G)構(gòu)建 ML樹(自舉1000次)；利用MrBayes 3.1.2軟件以最優(yōu)模型(GTR+I+G)構(gòu)建BI樹，采用馬爾科夫鏈的蒙特卡洛(Markov Chain Monte Carlo, MCMC)方法，共運(yùn)行100萬(wàn)代，舍去前1000個(gè)老化樣本。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南山鷓鴣線粒體全基因組序列結(jié)構(gòu)特征

海南山鷓鴣線粒體全基因組高通量測(cè)序最終組裝的有效數(shù)據(jù)為126.52 Mb，測(cè)序深度為7 668.06 X。海南山鷓鴣線粒體全基因組序列長(zhǎng)度為 16 730 bp (GenBank登錄號(hào)：KJ716444)，編碼13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因(12S和16S rRNA)以及1個(gè)控制區(qū)(CR)。海南山鷓鴣線粒體基因組結(jié)構(gòu)緊湊，基因排列順序與鳥類線粒體基因典型的排列方式一致[18](附表2)。

2.1.1 蛋白質(zhì)編碼基因

13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因全長(zhǎng)11 355 bp(不包括終止密碼子)，共編碼3785個(gè)氨基酸，除ND6基因定位在N鏈上外，其余均定位在J鏈上。ND3基因第174位置存在胞嘧啶插入。起始密碼子除COI基因?yàn)镚TG、ND5為ATA外，其余均為標(biāo)準(zhǔn)的ATG；有1個(gè)基因的終止密碼子為AGG(COI)，1個(gè)為TAG (ND6)，3個(gè)為不完全終止密碼子T(ND2、COIII和ND4)，其余基因均為標(biāo)準(zhǔn)的TAA。在所編碼的3785個(gè)氨基酸中，使用最頻繁的氨基酸為 Leu，占所有氨基酸的17.78%。

2.1.2 rRNA和tRNA基因

12S和 16S rRNA 基因分別位于 tRNAPhe和tRNAVal以及 tRNAVal和 tRNALeu(UUR)之間，基因長(zhǎng)度分別為972 bp和1629 bp。預(yù)測(cè)的12S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)包含 3個(gè)結(jié)構(gòu)域，46個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖 1)；16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)含有6個(gè)結(jié)構(gòu)域，59個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2)。22個(gè)tRNA基因的長(zhǎng)度為66～77 bp，其中14個(gè)由J鏈編碼，8個(gè)由N鏈編碼。除tRNASer(AGY)(缺失DHU臂)之外，其余21種tRNA均可形成典型的三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)。所有tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)中共存在31處堿基錯(cuò)配現(xiàn)象，其中G-U錯(cuò)配出現(xiàn)的頻率最高。

2.1.3 控制區(qū)

控制區(qū)長(zhǎng)度為1178bp，位于tRNAGlu和tRNAPhe之間，其中包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：ETAS(extended termination-associated sequence)結(jié)構(gòu)域I (nt 1～315)，中央保守結(jié)構(gòu)域II (nt 316～785)和CSB結(jié)構(gòu)域III (nt 786～1178)[19～21](附圖1)。ETAS結(jié)構(gòu)域I包括類似于雪雁(Anas caerulescens)“goose hairpin”的序列(36-64)[22]、ETAS1(64～126)和 ETAS2(124～163)保守區(qū)。中央保守結(jié)構(gòu)域II中含有F box、E box、D box、C box和Bird similarity box[23]保守序列。CSB結(jié)構(gòu)域III包含類似哺乳動(dòng)物重鏈復(fù)制起始位點(diǎn)的 poly(C)序列(OH，nt 786～797)，且含有翻譯的雙向啟動(dòng)子(LSP和HSP，nt 998～1020)。

2.2 山鷓鴣屬鳥類線粒體基因組比較

4種山鷓鴣屬鳥類線粒體基因組的結(jié)構(gòu)和組成類似。除四川山鷓鴣之外，其他 3種山鷓鴣屬鳥類ND3基因第 174位置均存在胞嘧啶插入。利用mitogenome聯(lián)合數(shù)據(jù)集計(jì)算的未校正P距離中，白眉山鷓鴣與紅喉山鷓鴣之間的距離最小(0.04)，四川山鷓鴣和海南山鷓鴣之間的距離最大(0.088)。

2.2.1 A+T含量和核苷酸偏向性

圖1 海南山鷓鴣線粒體基因組12S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及與其他3種山鷓鴣屬鳥類的比較I、II和III表示結(jié)構(gòu)域，數(shù)字1～46表示莖區(qū)結(jié)構(gòu)的數(shù)目，*表示錯(cuò)配；白眉山鷓鴣(A.gin)、紅喉山鷓鴣(A.rufo)和四川山鷓鴣(A.rufi)12S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與海南山鷓鴣不同之處被標(biāo)出。

對(duì)4種山鷓鴣鳥類線粒體全基因組、13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、核糖體RNA基因、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因及控制區(qū)等區(qū)域的堿基組成和核苷酸偏向性分析結(jié)果見(jiàn)附圖 2。本研究結(jié)果表明，線粒體基因組不同區(qū)域的A+T含量、AT和GC偏向性在山鷓鴣屬鳥類中是類似的。山鷓鴣屬鳥類線粒體全基因組A+T含量略大于G+C含量，具有明顯的GC偏向性(C含量遠(yuǎn)大于G)。線粒體基因組4種不同類型的劃分中，A+T含量大致為：CR＞tRNA＞PCG＞rRNA，其中，tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)序列(tRNA-loop)表現(xiàn)出較高的 A+T含量；AT偏向性在蛋白質(zhì)編碼基因密碼子第二位點(diǎn)(PCG-2nd，T含量遠(yuǎn)大于A)和第三位點(diǎn)(PCG-3rd，A含量遠(yuǎn)大于T)較為明顯；蛋白質(zhì)編碼基因密碼子第三位點(diǎn)(PCG-3rd)表現(xiàn)出明顯的GC偏向性，C含量遠(yuǎn)大于G。

2.2.2 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

山鷓鴣屬鳥類線粒體rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中多數(shù)莖區(qū)序列較為保守，而環(huán)區(qū)變化較大(圖1和圖2)，例如16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)莖區(qū)44上方環(huán)區(qū)中含有多處替換。山鷓鴣屬鳥類 tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的莖區(qū)序列較為保守，保守位點(diǎn)(Conserved sites, C)比例高達(dá)96%，環(huán)區(qū)變化較大。tRNA莖區(qū)中存在大量G-U錯(cuò)配，這種配對(duì)方式仍然能夠形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，且在維系tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中，tRNALeu(UCN)較為保守，而 tRNAPhe和tRNALys變化相對(duì)較大。

2.2.3 蛋白質(zhì)編碼基因密碼子及氨基酸使用頻率

山鷓鴣屬鳥類中絕大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因的起始和終止密碼子較為保守。起始密碼子一般為ATG，但COI基因以GTG為起始密碼子。終止密碼子共有4種類型(TAA、AGG、TAG和不完全終止密碼子T)，AGG僅存在于COI中；TAG僅出現(xiàn)在山鷓鴣屬鳥類ND6基因及四川山鷓鴣Cytb基因中；ND2、COIII和ND4基因以不完全密碼子T為終止；其他基因均以TAA為終止密碼子。PCG數(shù)據(jù)集中，UCA、CUA和CGA密碼子的使用頻率較高；PCG數(shù)據(jù)集翻譯成的氨基酸序列中，Leu使用頻率最高，Cys最低。

2.3 同義替換率和非同義替換率

山鷓鴣屬鳥類線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的Ks值明顯高于Ka(附圖3)。6個(gè)分組中，ATP8基因Ka值普遍較高，COI基因Ka值則較低。紅喉山鷓鴣-白眉山鷓鴣中大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因的Ka和Ks數(shù)值小于其他5個(gè)分組。山鷓鴣屬鳥類Ka/Ks值均小于 1，這表明山鷓鴣屬物種蛋白質(zhì)編碼基因受到了純化選擇的作用。ATP8基因的Ka/Ks數(shù)值較高，ND系列基因數(shù)值處于中等，CO系列、ATP6和Cytb基因的數(shù)值較低。此外，大多數(shù)基因的P值(來(lái)自于Fisher精確檢驗(yàn))均明顯小于0.001，表明各組的差異達(dá)到了顯著水平。本研究進(jìn)一步對(duì)上述 6個(gè)分組的PCG數(shù)據(jù)集分別統(tǒng)計(jì)序列的轉(zhuǎn)換(Ts)和顛換(Tv)，結(jié)果表明：堿基轉(zhuǎn)換數(shù)目遠(yuǎn)高于顛換數(shù)目；PCG-3rd中轉(zhuǎn)換與顛換的數(shù)目明顯大于PCG-1st和PCG-2nd；白眉山鷓鴣-紅喉山鷓鴣中 PCG、PCG-1st和PCG-3rd的Ts/Tv數(shù)值均高于其他5個(gè)組。

2.4 山鷓鴣屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

本研究基于線粒體基因組聯(lián)合數(shù)據(jù)集構(gòu)建的ML和BI樹具有一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖3)。白眉山鷓鴣與紅喉山鷓鴣互為姐妹群，而后再與四川山鷓鴣聚在一起，海南山鷓鴣則位于山鷓鴣屬的基部位置；山鷓鴣屬的單系性得到了良好地支持，且山鷓鴣屬位于所有雉科鳥類的基部。

3 討 論

3.1 線粒體基因組特征

山鷓鴣屬鳥類線粒體基因組中多個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因使用不完全終止密碼子 T，這類密碼子在脊椎動(dòng)物中較為常見(jiàn)[24]。通常情況下，不完整的終止密碼子與相鄰的tRNA之間存在重疊序列，該終止密碼子能夠利用轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程將其補(bǔ)充為完整的TAA，有些學(xué)者認(rèn)為 tRNA在此過(guò)程中起主要作用[25,26]。除四川山鷓鴣外，其他3種山鷓鴣屬物種ND3基因174位置存在胞嘧啶的插入現(xiàn)象，在轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程中，這個(gè)額外插入的堿基被RNA通過(guò)自我修復(fù)剪切掉，從而有效地避免了因移碼突變導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄提前終止[27]。四川山鷓鴣 ND3基因中不存在胞嘧啶插入，這可能是鳥類快速輻射進(jìn)化在線粒體基因組中的遺留物，也可能是自然選擇的結(jié)果[28]。tRNA-loop的A+T含量較高，而PCG-1st和tRNA-stem的A+T含量較低，線粒體基因組不同分區(qū)的AT趨勢(shì)可能是轉(zhuǎn)錄耦合的修復(fù)和脫氨基作用的結(jié)果[29]。山鷓鴣屬鳥類rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)變化較大，莖區(qū)較為保守[30,31]，這可能是因?yàn)閮烧咚艿倪x擇壓力不同。tRNASer(AGY)缺少DHU臂，這種現(xiàn)象在脊椎動(dòng)物中較常見(jiàn)[32]，而缺失DHU臂后的tRNASer(AGY)仍可形成倒L型三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)維持CCA接受臂與反密碼子間的距離[33]。

圖3 mitogenome數(shù)據(jù)集構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分支支持度依次為MP/ML/BI，其中*表示MP建樹結(jié)果與ML/BI不同。

3.2 同義替換率和非同義替換率

山鷓鴣屬鳥類蛋白質(zhì)編碼基因處于純化選擇作用下，這種現(xiàn)象普遍存在于其他物種中，例如蝽[34]、長(zhǎng)棘海星屬[35]、真鯊目和鰩形目[36]、翼手目[37]、絨螯蟹屬和青蟹屬[38]、庸鰈屬和星鰈屬及舌鰨屬[39]、橈足動(dòng)物[40]。山鷓鴣屬鳥類線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因中，ATP8基因Ka/Ks值較大，COI基因Ka/Ks值較小，這與其他學(xué)者的研究類似[34,35,37,38,40～42]，表明ATP8和COI基因分別經(jīng)歷了較弱和較強(qiáng)的選擇壓力。此外，Li等[34]的研究表明，蛋白質(zhì)編碼基因的Ka/Ks值與其GC含量之間存在負(fù)相關(guān)；且GC含量的變化可能會(huì)導(dǎo)致基因間出現(xiàn)不同的進(jìn)化模式[34,43]，但在本研究中，蛋白質(zhì)編碼基因的 Ka/Ks值與其相應(yīng)的GC含量之間未觀察到明顯的負(fù)相關(guān)性。

飛行能力是鳥類的重要特征，飛行過(guò)程中所需的絕大部分能量都是通過(guò)線粒體中的氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)生的，飛行速度快的鳥類應(yīng)該比飛行速度慢或不能飛行的鳥類具有更高效的能量代謝。對(duì)于善于飛行的鳥類而言，非同義突變大部分是有害的，一旦發(fā)生非同義替換，就會(huì)影響氧化磷酸化過(guò)程中能量的產(chǎn)生，也就不能滿足飛行的需求，所以這種有害的非同義突變就會(huì)被純化選擇消除。本研究中，山鷓鴣屬鳥類蛋白質(zhì)編碼基因Ka/Ks平均值為0.0513，與Shen等[44]研究中不善飛行組鳥類的Ka/Ks值(平均 0.05)接近，且高于其研究中善于飛行組鳥類的Ka/Ks值(平均0.04)，這表明不善飛行的山鷓鴣屬物種在進(jìn)化歷史中積累了更多的非同義替換。

3.3 山鷓鴣屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

4種山鷓鴣屬物種具有共同的生物學(xué)特征，例如上體呈橄欖褐色，繁殖期在4～6月份。相比而言，紅喉山鷓鴣和白眉山鷓鴣的形態(tài)學(xué)特征更為相似，例如，眼周裸出的皮膚為紅色，嘴黑色，腿、腳紅色，而四川山鷓鴣的腿、腳赭褐色，海南山鷓鴣的嘴灰色，腳深粉紅色，這與上述紅喉山鷓鴣和白眉山鷓鴣具有較明顯的差別。本研究的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明：白眉山鷓鴣與紅喉山鷓鴣互為姐妹群，顯示出較近的親緣關(guān)系，這與上述形態(tài)學(xué)特征及未校正P距離結(jié)果是一致的；海南山鷓鴣位于山鷓鴣屬的基部位置，與其他3種山鷓鴣屬鳥類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與 Wang等[45]的研究結(jié)果一致。山鷓鴣屬位于雉科的基部位置，與其他雉科鳥類形成姐妹群關(guān)系，這種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與Crowe等[46]、李喜鳳[47]的研究結(jié)果類似。

附錄：附表及附圖見(jiàn)WWW.Chinagene.cn。

[1] 鄭光美. 中國(guó)鳥類分類與分布名錄. 北京: 科學(xué)出版社, 2005.

[2] 高育仁. 海南山鷓鴣. 見(jiàn)盧汰春主編: 中國(guó)瀕危野生雞類. 福州: 福建科學(xué)技術(shù)出版社, 1991: 149-153.

[3] 李湘濤. 中國(guó)雞形目鳥類種與亞種的分布和生存現(xiàn)狀(英文). 動(dòng)物學(xué)報(bào), 1996, 42(增刊): 25-30.

[4] 汪松, 鄭光美, 王歧山. 中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書: 鳥類.北京: 科學(xué)出版社, 1998.

[5] IUCN 2013. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2013. 2. ＜http://www.iucnredlist.org＞

[6] 梁偉, 史海濤, 王力軍. 對(duì)海南省設(shè)立省鳥的探討. 海南師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2002, 15(2): 67-70.

[7] 高育仁. 海南山鷓鴣的換羽. 中國(guó)動(dòng)物科學(xué)研究——中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)第十四屆會(huì)員代表大會(huì)及中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì) 65周年年會(huì)論文集, 1999: 498-501.

[8] 韋鋒. 海南山鷓鴣的活動(dòng)區(qū)和夜棲地利用[學(xué)位論文].海南師范大學(xué), 2008.

[9] 楊燦朝. 海南鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)海南山鷓鴣(Arborophila ardens)的領(lǐng)域、活動(dòng)區(qū)和生境利用[學(xué)位論文]. 海南師范大學(xué), 2007.

[10] 黨江鵬, 劉念, 葉偉, 黃原. 云斑車蝗線粒體基因組全序列測(cè)定與分析. 昆蟲學(xué)報(bào), 2008, 51(7): 671-680.

[11] Sorenson MD. Avian mtDNA primers. 2003. ＜http:// people.bu.edu/msoren/ Primers.html＞

[12] Lowe TM, Eddy SR. tRNAscan-SE: A program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res, 1997, 25(5): 955-964.

[13] 楊超, 雷富民, 黃原. 地山雀線粒體基因組全序列的測(cè)定與分析. 動(dòng)物學(xué)研究, 2010, 31(4): 333-344.

[14] 柯楊, 黃原, 雷富民. 黑尾地鴉線粒體基因組序列測(cè)定與分析. 遺傳, 2010, 32(9): 951-960.

[15] Burk A, Douzery EJP, Springer MS. The secondary structure of mammalian mitochondrial 16S rRNA molecules: refinements based on a comparative phylogenetic approach. J Mam Evol, 2002, 9(3): 225-252.

[16] Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis software for microcomputers. Comput Appl Biosci, 1994, 10(2): 189-191.

[17] Zhang Z, Li J, Zhao XQ, Wang J, Wong GKS, Yu J. KaKs-Calculator: calculating Ka and Ks through model selection and model averaging. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2006, 4(4): 259-263.

[18] Mindell DP, Sorenson MD, Dimcheff DE. Multiple independent origins of mitochondrial gene order in birds. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(18): 10693-10697.

[19] Brown GG, Gadaleta G, Pepe G, Saccone C, Sbisà E. Structural conservation and variation in the D-loop-containing region of vertebrate mitochondrial DNA. J Mol Biol, 1986, 192(3): 503-511.

[20] Randi E, Lucchini V. Organization and evolution of the mitochondrial DNA control region in the avian genus Alectoris. J Mol Evol, 1998, 47(4): 449-462.

[21] Saccone C, Pesole G, Sbisá E. The main regulatory region of mammalian mitochondrial DNA: structure-function model and evolutionary pattern. J Mol Evol, 1991, 33(1): 83-91.

[22] Quinn TW. The genetic legacy of Mother Goose-phylogeographic patterns of lesser snow goose Chen caerulescens caerulescens maternal lineages. Mol Ecol, 1992, 1(2): 105-117.

[23] Ruokonen M, Kvist L. Structure and evolution of the avian mitochondrial control region. Mol Phyl Evol, 2002, 23(3): 422-432.

[24] Cui ZX, Liu Y, Li CP, You F, Chu KH. The complete mitochondrial genome of the large yellow croaker, Larimichthys crocea (Perciformes, Sciaenidae): unusual features of its control region and the phylogenetic position of the Sciaenidae. Gene, 2009, 432(1-2): 33-43.

[25] Quinn TW. Molecular evolution of the mitochondrial genome. In: Mindell DP. Avian Molecular Evolution and Systematics. San Diego: Academic Press, 1997: 3-28.

[26] Ojala D, Montoya J, Attardi G. tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria. Nature, 1981, 290(5806): 470-474.

[27] Mindell DP, Sorenson MD, Dimcheff DE. An extra nucleotide is not translated in mitochondrial ND3 of some birds and turtles. Mol Biol Evol, 1998, 15(11): 1568-1571.

[28] 高英凱, 苗永旺, 蘇小茜, 池振奮, 俞贇, 姜楓. 74 種鳥類線粒體基因組堿基組成及特征分析. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 24(1): 51-58.

[29] Francino MP, Ochman H. Strand asymmetries in DNA evolution. Trends Genet, 1997, 13(6): 240-245.

[30] Woese CR, Magrum LJ, Gupta R, Siegel RB, Stahl DA,Kop J, Crawford N, Brosius J, Gutell R, Hogan JJ, Noller HF. Secondary structure model for bacterial 16S ribosomal RNA: phylogenetic, enzymatic and chemical evidence. Nucleic Acids Res, 1980, 8(10): 2275-2293.

[31] Noller HF. Structure of ribosomal RNA. Annu Rev Biochem, 1984, 53(1): 119-162.

[32] H?rlid A, Janke A, Arnason U. The mtDNA sequence of the ostrich and the divergence between paleognathous and neognathous birds. Mol Biol Evol, 1997, 14(7): 754-761.

[33] Hanada T, Suzuki T, Watanabe K. Translation activity of mitochondrial tRNA with unusual secondary structure. Nucl Acids Symp Ser, 2000, 44(1): 249-250.

[34] Li H, Liu H, Shi AM, ?tys P, Zhou XG, Cai WZ. The Complete Mitochondrial Genome and Novel Gene Arrangement of the Unique-Headed Bug Stenopirates sp. (Hemiptera: Enicocephalidae). PLoS ONE, 2012, 7(1): e29419.

[35] 田美, 申欣, 孟學(xué)平, 程漢良. 7個(gè)海星動(dòng)物線粒體基因組比較及基因變異位點(diǎn)分析. 臺(tái)灣海峽, 2012, 31(2): 189-194.

[36] 申欣, 田美, 孟學(xué)平, 程漢良. 10種軟骨魚線粒體基因組特征分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2011, 32(3): 26-32.

[37] Meganathan PR, Pagan HJT, McCulloch ES, Stevens RD, Ray DA. Complete mitochondrial genome sequences of three bats species and whole genome mitochondrial analyses reveal patterns of codon bias and lend support to a basal split in Chiroptera. Gene, 2012, 492(1): 121-129.

[38] 田美, 申欣, 孟學(xué)平, 程漢良. 短尾派線粒體基因組特征及基因差異位點(diǎn)分析. 水產(chǎn)科學(xué), 2011, 30(1): 31-37.

[39] 申欣, 田美, 孟學(xué)平, 程漢良, 許建和, 閻斌倫. 鲆鰈類線粒體基因排列、特征比較及系統(tǒng)發(fā)生分析. 水產(chǎn)科學(xué), 2013, 32(10): 590-596.

[40] Wang MX, Sun S, Li CL, Shen X. Distinctive mitochondrial genome of Calanoid copepod Calanus sinicus with multiple large non-coding regions and reshuffled gene order: Useful molecular markers for phylogenetic and population studies. BMC Genomics, 2011, 12(1): 73.

[41] Helfenbein KG, Fourcade HM, Vanjani RG, Boore JL. The mitochondrial genome of Paraspadella gotoi is highly reduced and reveals that chaetognaths are a sister group to protostomes. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(29): 10639-10643.

[42] Papillon D, Perez Y, Caubit X, Le Parco Y. Identification of chaetognaths as protostomes is supported by the analysis of their mitochondrial genome. Mol Biol Evol, 2004, 21(11): 2122-2129.

[43] Hua JM, Li M, Dong PZ, Cui Y, Xie Q, Bu WJ. Comparative and phylogenomic studies on the mitochondrial genomes of Pentatomomorpha (Insecta: Hemiptera: Heteroptera). BMC Genomics, 2008, 9(1): 610.

[44] Shen YY, Shi P, Sun YB, Zhang YP. Relaxation of selective constraints on avian mitochondrial DNA following the degeneration of flight ability. Genome Res, 2009, 19(10): 1760-1765.

[45] Wang N, Kimball RT, Braun EL, Liang B, Zhang ZW. Assessing phylogenetic relationships among galliformes: a multigene phylogeny with expanded taxon sampling in phasianidae. PLoS ONE, 2013, 8(5): e64312.

[46] Crowe TM, Bowie RCK, Bloomer P, Mandiwana TG, Hedderson TAJ, Randi E, Pereira SL, Wakeling J. Phylogenetics, biogeography and classifcation of, and character evolution in, gamebirds (Aves: Galliformes): effects of character exclusion, data partitioning and missing data. Cladistics, 2006, 22(6): 495-532.

[47] 李喜鳳. 雞形目、鶴形目和雀形目七種鳥類線粒體全基因組的測(cè)定與分析[學(xué)位論文]. 安徽師范大學(xué), 2012.

(責(zé)任編委: 李 輝)

Comparative and phylogenomic analyses on mitochondrial genomes of Arborophila species

Xuejuan Li1, Yuan Huang1, Fumin Lei2

1. School of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China;
2. Key Laboratory of Zoological Systematics and Evolution, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Arborophila ardens, an endangered species, has a strict habitat preference and sparse population. In order to further study evolution and phylogenetic relationship of Arborophila, the mitochondrial genome (mitogenome) of A. ardens was obtained by Illumina Hiseq2000 high-throughput sequencing. The comparative genomic analyses were made among four Arborophila species, and phylogenetic relationship of Arborophila was discussed. The results revealed that: (1) the complete mitogenome of A. ardens is 16 730 bp in length, including 13 protein-coding genes (PCGs), two ribosomal RNA genes (rRNAs), 22 transfer RNA genes (tRNAs) and a control region (CR); (2) Arborophila species were affected by purifying selection, and more nonsynonymous substitutions were accumulated in the process of evolution; (3) Arborophila was at the basal position of Phasianidae within the phylogenetic tree, and A. gingica was placed as sister to A. rufogularis, while A. ardens formed the basal position of Arborophila, which indicated a distant genetic relationship with other three species.

Arborophila ardens; mitochondrial genome; comparative genomics; phylogeny

附表1 海南山鷓鴣線粒體基因組PCR擴(kuò)增引物

2014-03-14;

2014-07-25

國(guó)家杰出青年科學(xué)基金(編號(hào)：30925008)和中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(編號(hào)：O529YX5105)

李雪娟，博士研究生，研究方向：分子進(jìn)化生物學(xué)。E-mail: lixuejuan456@163.com

黃原，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子進(jìn)化與分子系統(tǒng)學(xué)。E-mail: yuanh@snnu.edu.cn

雷富民，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：鳥類學(xué)。E-mail: leifm@ioz.ac.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0912

時(shí)間: 2014-8-12 14:16:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140812.1416.001.html