雷蒙德氏棉HSP70基因家族的進化分析及其同源基因在陸地棉中的表達分析

張毓婷，王敏華，陳家棟，戎均康,3，丁明全,3

1. 浙江農林大學，亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，臨安 311300；

2. 浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院，浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，臨安 311300；

3. 中國農業(yè)科學院棉花研究所，棉花生物學國家重點實驗室，安陽 45500

雷蒙德氏棉HSP70基因家族的進化分析及其同源基因在陸地棉中的表達分析

張毓婷1,2，王敏華1,2，陳家棟2，戎均康2,3，丁明全2,3

1. 浙江農林大學，亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，臨安 311300；

2. 浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院，浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，臨安 311300；

3. 中國農業(yè)科學院棉花研究所，棉花生物學國家重點實驗室，安陽 45500

熱激蛋白70家族(HSP70)是一類在植物中高度保守的分子伴侶蛋白，在細胞中協(xié)助蛋白質正確折疊。文章利用隱馬可鏈夫模型(HMM)在雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii L.)全基因組范圍內進行HSP70基因家族成員進化分析，共得到30個HSP70家族成員。利用生物信息學對雷蒙德氏棉HSP70基因的結構、染色體分布、基因倍增模式以及系統(tǒng)進化進行分析，結果表明，HSP70基因家族根據亞細胞定位結果可分為不同的基因亞家族，各亞家族中HSP70基因具有相對保守的基因結構；染色體片段重復和串聯重復是雷蒙德氏棉HSP70基因家族擴增的主要方式。通過對不同物種的HSP70基因家族進行系統(tǒng)進化分析可知，HSP70亞組的分化發(fā)生在單細胞植物形成前，且細胞質型 HSP70成員大量擴增。比較陸地棉棉纖維發(fā)育不同時期的深度測序表達譜，發(fā)現HSP70基因可能參與棉纖維的生長發(fā)育。本研究結果有助于了解棉屬植物 HSP70基因家族的功能，以期為深入研究棉纖維發(fā)育過程中的分子調控機理提供基礎。

棉纖維；HSP70家族；深度測序；基因結構；系統(tǒng)進化分析

棉纖維是全球重要的紡織原料之一，具有極其重要的經濟價值。棉纖維是單細胞發(fā)育的典型模型，是研究細胞生長發(fā)育的極佳材料，了解其發(fā)育過程的機理具有重大意義[1]。棉纖維由胚珠外珠被表皮層的單細胞分化伸長形成，需要經歷纖維原始細胞的分化和突起、初生壁伸長、次生壁增厚和脫水成熟4個依次并相互重疊的過程，一般歷時45～50 d，涉及上千個基因的特異表達和蛋白相互作用[2,3]。目前，陸地棉(Gossypium hirsutum)是栽培面積及經濟價值最大的栽培棉種，異源四倍體(AD染色體組)的形成約發(fā)生在1～2百萬年前，普遍認為其D組染色體組的供體為雷蒙德氏棉(G. raimondii)。二倍體棉花雷蒙德氏棉基因組的測序工作已完成[4～6]。

熱激蛋白(Heat shock protein, HSP)是一類在生物體受到高溫等逆境脅迫后大量表達的蛋白，用以協(xié)助蛋白質正確折疊，保護胞內蛋白質免受應激損傷，進而維持生物體的正常生理活動[7]。按分子量大小可將熱激蛋白家族分為以下幾族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子sHSPs以及泛素蛋白[8]。其中，HSP70是分布最廣、保守性最高的一支熱激蛋白家族，其家族成員分布在細胞內的各個部位[9]。HSP70基因家族各成員由 3個部分組成：含有ATP酶結合域(ATPase domain)的N-端保守區(qū)，又稱為環(huán)核苷酸結合域(Nucleotide binding domain, NBD)，分子量約為44 kDa；可變C-端區(qū)域，分子量約為10 kDa；緊連ATPase結構域的一段多肽結合部位，該段區(qū)域氨基酸序列相對保守，分子量約為15 kDa[10,11]。由于HSP110與HSP70家族具有高度同源的基因序列和結構特征，所以盡管具有相對較大的分子量，也將其歸為 HSP70超家族[12]。相比于動物HSP70的研究，植物HSP70家族才剛剛起步。已知在擬南芥(Arabidopsis thaliana)全基因組中共編碼18個HSP70基因家族成員，其中14個只屬于HSP70，另有4個為HSP110家族成員[13]。菠菜(Spinacia oleracea L.)中至少有12個HSP70基因[14]，水稻(Oryza sativa)全基因組共含有32個HSP70家族成員[15]。

HSP70基因根據表達情況可以分為組成型和誘導型，組成型HSP70基因在植物體內普遍表達，可作為看家基因，而誘導型HSP70基因則只在受到外界刺激或特定的發(fā)育需要時大量表達[16]。植物HSP70的表達受高溫等非生物脅迫的誘導[13,15]，也受病原體入侵的調控，同時與植物發(fā)育相關[17]。朱一超等[18]應用cDNA芯片技術進行纖維伸長發(fā)育期的基因表達研究，發(fā)現在棉纖維發(fā)育過程中 HSP70基因在李氏超短纖維突變體材料中的表達量低于野生型材料。同時，在蛋白質水平上，也有研究發(fā)現HSP70互作蛋白在棉纖維發(fā)育過程中表達上調[19]。由此可知，熱激蛋白70家族對棉纖維的發(fā)育起著重要作用。本研究利用生物信息學方法，對雷蒙德氏棉全基因組的HSP70基因進行了預測和系統(tǒng)進化分析，并對其在棉纖維發(fā)育過程中的基因表達進行分析，旨在為棉花優(yōu)質、高產等重要農藝性狀提供候選基因，為基因組水平上的棉花分子育種工作提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 雷蒙德氏棉及其他物種 HSP70基因家族的數據獲取

雷蒙德氏棉、可可(Theobroma cacao)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、小立碗蘚(Physcomitrella pattens)、卷柏(Selaginella moellendorffii)及火炬松(Pinus taeda)基因組及蛋白質序列均來自于Phytozome V9.0 (http://www.phytozome.net)數據庫。根據文獻下載擬南芥18個HSP70家族基因[13]，利用隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model, HMM)在雷蒙德氏棉全蛋白質序列數據庫中搜索HSP70預測基因，所有預測基因序列在 SMART (http://smart. embl-heidelberg.de)和 InterProScan (http://www.ebi. ac.uk/interpro)、Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)數據庫中進行HSP70蛋白保守結構域的檢查，E值設定為＜ e?20，其他參數為默認值。用同樣方法獲得可可、小立碗蘚、卷柏和火炬松的HSP70家族序列。利用水稻HSP70家族相關文獻上的序列獲得單子葉植物二穗短柄草 HSP70基因家族成員[15]，方法如上述。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)HSP70基因根據Renner等[20]報道的序列登錄號下載。

1.2 基因復制共線性分析

利用BLAST軟件將所獲得的GrHSP70基因重新在基因組序列中定位，采用in-house python script軟件對其分布情況進行直觀展現，遵循其在染色體上的位置順序將雷蒙德氏棉30個HSP70基因編號為 GrHSP70-1至 GrHSP70-24和 GrHSP110-1至GrHSP110-6。參照 Maher等[21]方法對 GrHSP70進行基因倍增模式分析。當幾個HSP70基因位于同一或相鄰的基因間區(qū)域(Intergenic region)，則這些HSP70基因為串聯重復(Tandem duplication)產物。取GrHSP70基因上、下游各30個蛋白質編碼基因，將每一個蛋白質編碼基因與雷蒙德氏棉基因組數據庫中的蛋白質序列進行BLASTP比對，E值設定為＜0.001，獲取與該蛋白質最佳非自我匹配基因(The best no-self matches)。利用MCScanX軟件對HSP70基因家族成員所在基因組區(qū)段進行基因復制共線性分析[22]。

1.3 HSP70蛋白序列的進化分析和基序分布

HSP70蛋白序列的多重比對利用ClustalX 1.81完成，參數為默認值。將生成的“.aln”文件導入MEGA 5.0，采用鄰接法(Neighbor-joining)構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap重復次數(Replications)設置為“500”[23]。

1.4 雷蒙德氏棉HSP70基因結構分析

利用GrHSP70基因的編碼區(qū)序列(CDS)與全基因組序列比對，在 PIECE網站上(http://wheat.pw. usda.gov/piece/GSDraw.php)得到各基因的內含子、外顯子的個數和排布情況。HSP70基因亞細胞定位預測采用WoLFPSORT(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)、Softberry(http://www.softberry.com/)和 TargetP(http: //www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)數據庫，綜合上述3個軟件的預測結果進行基因亞細胞定位分析。

1.5 棉纖維不同發(fā)育時期的表達分析

1.5.1 深度測序表達譜的獲得與分析

陸地棉標準系 TM-1纖維和胚珠不同時期的深度測序表達譜下載于 NCBI網站 SRA數據庫(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)。測序原始數據Fastq文件登錄號分別為0 dpa(days post anthesis)：SRX139593；3 dpa：SRX139594；7 dpa：：SRX139595；15 dpa：SRX139596。利用In house perl script 分析HSP70基因家族每個基因的表達量。利用層次聚類算法分別分析HSP70基因在棉纖維和胚珠不同發(fā)育時期的表達數據。通過Cluster3.0展現層次聚類結果。

1.5.2 棉纖維不同發(fā)育時期的RNA提取及反轉錄

采用改良的CTAB法提取植物總RNA[24]，樣品分別為陸地棉TM-1開花當天0 dpa和3 dpa的胚珠、7 dpa和15 dpa纖維。粗提的RNA用DNase-Ⅰ(TaKaRa)進行處理，確保沒有基因組DNA的污染。消化后的RNA樣品采用Nanodrop ND-1000分光光度計進行定量，利用A260/A280nm和A260/A230nm的比值對樣品質量進行鑒定。每個樣品都采用 2 μg的RNA總量，運用反轉錄酶M-MLV(TaKaRa)完成cDNA的合成。采用HSP70基因特異性引物進行RT-PCR擴增，驗證深度測序表達譜的分析結果。

1.5.3 RT-PCR結果檢測

將上述方法得到的cDNA模板進行表達分析，分別選取HSP70-11、HSP70-12、HSP70-20、HSP70-24和HSP110-6基因，對其在棉纖維發(fā)育不同時期的表達進行實時定量PCR檢測。PCR引物采用Primer 5.0軟件設計，在基因序列 3′端特異性區(qū)域設計引物，擴增片段約為200 bp左右，由上海華大基因合成，所用引物序列見表 1。根據棉花看家基因泛素蛋白基因(Ubiquitin, UBQ)作為熒光定量 PCR擴增反應的內參，按照 2-ΔΔCt法計算基因的相對表達值[25]。實驗中每種材料采集3組重復樣品，進行3次重復提取RNA，每個樣品的RNA需進行3次重復，共計9組實驗結果，計算其平均值和標準差。

表1 PCR擴增引物

2 結果與分析

2.1 雷蒙德氏棉基因組中的HSP70基因分析

利用已知的擬南芥18個HSP70基因作為模板，運用HMMER軟件在雷蒙德氏棉全基因組中共檢索到30個GrHSP70基因，經過BLAST和結構域分析，確定這 30個基因均具有熱激蛋白家族的保守蛋白結構域。其中，24個屬于HSP70亞家族，按其在染色體上的位置分布，將這24個HSP70基因依次命名為：GrHSP70-1～GrHSP70-24，另外 6個基因歸為HSP110/SSE亞家族，命名為GrHSP110-1～GrHSP110-6 (表2)。根據HSP70基因C-端的不同基序，進行亞細胞定位預測(表2)[14]。發(fā)現GrHSP70-1、GrHSP70-3、GrHSP70-4、GrHSP70-7、GrHSP70-9、GrHSP70-10、GrHSP70-13、GrHSP70-17、GrHSP70-18、GrHSP70-19、GrHSP70-20、GrHSP70-22和GrHSP70-24定位在細胞質中；GrHSP70-2、GrHSP70-5、GrHSP70-11、GrHSP70-12、GrHSP70-23定位于內質網中。GrHSP70-6、GrHSP70-8和GrHSP70-21定位于質體內。GrHSP70-14、GrHSP70-15、GrHSP70-16定位于線粒體中。將雷蒙德氏棉HSP70家族在擬南芥和水稻中的同源基因進行比較，可以發(fā)現它們具有相似的亞細胞定位情況[13,15]。

表2 雷蒙德氏棉HSP70基因家族基因組分析

續(xù)表2

2.2 GrHSP70基因家族序列特征和基序分布

將雷蒙德氏棉30個熱激蛋白70家族的蛋白質序列進行系統(tǒng)進化分析，可以將其分為2個亞家族：HSP70亞家族和HSP110亞家族(圖 1a)。每個亞家族內的基因按照不同的亞細胞定位結果，HSP70中的基因可分為4組(圖1：A～D組)，分別定位于細胞質、內質網、質體和線粒體；HSP110亞家族集中分布于細胞質和內質網中。分析這些基因氨基酸序列和其對應的DNA及mRNA序列，可得出基因結構圖(圖1b)。HSP110亞家族成員個數較少，具有基因序列長和內含子數目多的特點。HSP70亞家族成員個數較多，其中：A組的HSP70基因特點為均定位于細胞質中，基因中內含子數目少；B組為內質網類型，含有5個HSP70基因，核苷酸序列結構比A組復雜，平均具有8個外顯子；C組和E組分別對應著質體類型和線粒體類型，這兩個亞家族進化關系較近，同屬于一個大的分支。

圖1 GrHSP70家族系統(tǒng)進化樹和基因結構分析a：雷蒙德氏棉HSP70家族系統(tǒng)進化分析；b：雷蒙德氏棉HSP70家族基因外顯子-內含子的排布圖。外顯子和內含子分別用方框和黑線表示。

2.3 HSP70基因在二倍體棉花D組染色體上的分布

HSP70基因在棉花二倍體 D組的13條染色體上并不是均勻分布的，30個基因的具體定位情況見圖2。其中，1號和12號染色體上未檢測到HSP70基因，棉花第6號、第8號和第11號染色體上HSP70基因分布最多，均具有5個HSP70基因。HSP70基因在雷蒙德氏棉染色體上具有成簇分布的現象，在Phytozome數據庫中通過 Gbrowse查看成簇分布的HSP70基因家族成員與側翼蛋白質編碼基因的位置關系。同一家族的不同成員如果位于同一個或相鄰的基因間區(qū)域，則這些成員為串聯重復關系[26]。按照此標準，雷蒙德氏棉HSP70基因家族有7個成員形成了3個串聯重復組對(表3)。從Phytozome數據庫分別獲取雷蒙德氏棉HSP70基因家族各成員側翼30個蛋白質編碼基因，利用MCScanX軟件對HSP70家族成員所在基因組區(qū)段進行基因復制共線性分析。由圖3可知，部分雷蒙德氏棉HSP70基因家族成員之間存在顯著的共線性關系，如 HSP70-2與HSP70-5、HSP110-3與HSP110-6，這些HSP70基因所定位的染色體區(qū)段是基因組進化過程中染色體大片段重復的產物，即位于染色體倍增塊(Duplicated block)上。分析表明，共有15個HSP70基因家族成員位于 6對染色體倍增塊上(表 3)。在HSP70基因的6對倍增塊中還存在著交叉匹配的現象，即一個染色體片段同時與2個或3個染色體片段構成倍增塊。例如：HSP70-1、HSP70-7、HSP70-13和HSP70-19倍增塊，分別對應第2、6、7和9號染色體；HSP70-6、HSP70-8和HSP70-21倍增塊，分別位于第5、6和11號染色體。這些倍增塊的產生可能是由于染色體多次復制。

2.4 HSP70基因的系統(tǒng)進化分析

圖2 HSP70基因在雷蒙德氏棉染色體上的分布情況

表3 GrHSP70基因倍增模式分析表

圖3 雷蒙德氏棉HSP70基因在染色體上的共線性分析

為了進一步研究HSP70基因在不同物種中的進化情況，運用HMMER軟件在可可、二穗短柄草、小立碗蘚、卷柏和火炬松等物種的全基因組中搜索HSP70基因家族，加上文獻中下載到的萊茵衣藻、擬南芥和水稻的HSP70基因，將這9個物種的蛋白質序列進行系統(tǒng)進化分析[13,15](圖4)。根據基因進化關系將雷蒙德氏棉HSP70分為HSP70和HSP110兩個亞家族，在每個亞家族中根據基因的亞細胞定位情況又可將各亞家族基因細分(表 4)，分類結果與已報道的其他物種的HSP70相類似。其中萊茵衣藻的HSP70家族成員最少，分別具有5個HSP70亞族成員和2個HSP110亞族成員(系統(tǒng)進化樹中用紅色三角標注)，二穗短柄草的 HSP70家族成員最多，有26個HSP70亞族和8個HSP110亞族。從表4可以發(fā)現，HSP70基因各亞組的分化發(fā)生在單細胞植物衣藻形成之前，從最簡單的單細胞藻類到進化較高級的單子葉植物，都具有完整的HSP70家族成員種類。比較不同物種HSP70基因家族的亞組成員數可以發(fā)現，在低等植物衣藻中，各亞組中基本都只具有1到2個HSP70基因成員，而在較高等的植物中，HSP70基因個數有所增加，但不同亞組成員數增加的比例不同，總體來說，胞質型HSP70數目比其他亞組成員數增加較多，典型代表為火炬松，具有25個細胞質型HSP70基因，而細胞器特異性的HSP70基因個數幾乎與萊茵衣藻相同。由系統(tǒng)進化樹可知，線粒體型HSP70的進化關系基本符合植物的進化關系，由萊茵衣藻、小立碗蘚、卷柏為代表的低等植物形成一個外群體(Out group)，裸子植物火炬松與被子植物形成兩個分支，同時，單雙子葉植物分別聚類。相比線粒體型HSP70基因，其他亞組的HSP70的進化關系并不能明顯的呈現生物進化關系，尤其是胞質型 HSP70。因此推測在基因復雜的復制過程中可能發(fā)生了基因丟失(Gene lost)或基因轉換事件(Gene conversion)。

圖4 9個物種的HSP70基因家族的系統(tǒng)進化分析9個物種分別為雷蒙德氏棉(Gr)、擬南芥(At)、水稻(Os)、可可(Thecc)、二柄短尾草(Bradi)、萊茵衣藻(Cre)、小立碗蘚(Pp)、卷柏(Smo)和火炬松(PITA)。

表4 各物種中HSP70基因家族成員統(tǒng)計

2.5 HSP70基因在陸地棉TM-1纖維發(fā)育不同時期的表達分析

由于四倍體陸地棉是世界上分布最廣泛的棉種，研究HSP70基因在陸地棉纖維發(fā)育過程中的表達情況更具有實際意義。對陸地棉標準系 TM-1中GrHSP70家族的同源基因進行表達分析，深度測序數據選擇棉纖維發(fā)育的4個時期(0 dpa、3 dpa、7 dpa及15 dpa)。由圖5 A可知，HSP70-4、10、17、18、22和 23未在胚珠或纖維中檢測到表達。同時選取雷蒙德氏棉和陸地棉不同組織部位和時期的深度測序數據進行表達分析，除HSP70-22、23在雷蒙德氏棉葉片中表達外，其他 4個基因仍未檢測到表達，推測這 4個 HSP70基因為假基因。HSP70-2、HSP70-11、HSP70-13、HSP70-20及HSP110-3在這4個纖維發(fā)育的不同時期都高表達，推測這幾個基因在棉纖維發(fā)育各個過程中均起重要作用。同時，和對照0 dpa的胚珠表達相比(圖5 B)，在0 dpa表達量高，而之后逐漸下調的基因有 HSP70-2、11、12及HSP110-4、6；在0 dpa表達量低，在之后的發(fā)育時期表達量上升的基因有HSP70-24、20、13、8、19。其他 HSP70基因的表達在發(fā)育的某一時期具有特異性，如 HSP70-8在 7 dpa表達量較高，HSP70-3在3 dpa高表達。

圖5 GrHSP70基因家族在陸地棉中同源基因纖維不同發(fā)育時期的表達分析A：利用分層聚類算法分析HSP70基因在4個棉纖維發(fā)育階段(0 dpa、3 dpa、7 dpa、15 dpa)的深度測序數據，通過樹形視圖呈現分層聚類結果。紅色表示表達量高，綠色表示表達量較低。B：將各HSP70基因0 dpa的表達數據作為對照，其他3個時期(3 dpa、7 dpa、15 dpa)的芯片數據與其比較得到分層聚類結果。黃色表示表達量相對于0 dpa上調，黑色表示表達量不變，藍色表示表達下調。

選取表達量變化趨勢較明顯的幾組HSP70基因進行RT-PCR驗證，根據2-ΔΔCt法計算基因的相對表達值，結果如圖6所示，與0 dpa相比，HSP70-11、HSP70-12與HSP110-6在3 dpa、7 dpa和15 dpa表達呈下調趨勢，而HSP70-20和HSP70-24表達量與0 dpa相比逐漸升高。這些基因的表達趨勢與深度測序分析所得結果相同，說明深度測序的結果真實可靠。

圖6 HSP70基因RT-PCR表達分析A：HSP70-11；B：HSP70-12；C：HSP110-6；D：HSP70-24；E：HSP70-20。

3 討 論

本文在基因組水平上對雷蒙德氏棉HSP70基因進行了鑒定和功能分析。雷蒙德氏棉HSP70超家族共有30個成員，其中包括24個HSP70基因和6個HSP110基因，約為擬南芥中該基因家族成員個數的2倍，這說明雷蒙德氏棉染色體相比于擬南芥染色體，在進化過程中經歷了多次全基因組復制事件[13]。根據C-端的基序類型以及WOLF網站預測所得到的24個HSP70基因的亞細胞定位，將棉花HSP70基因進行分組，由此所得的4個HSP70亞家族與根據系統(tǒng)進化樹的分支進行的分組情況相符，表明該家族基因的亞細胞定位分化具有高度保守性。HSP110蛋白與HSP70蛋白的區(qū)別主要在于具有 N-端ATP酶結合域和 C-端之間的插入區(qū)段或 C-端的延長區(qū)域，較大的分子質量使HSP110自成一個亞家族[12]。比較GrHSP70基因的內含子、外顯子排布情況及基序的分布情況，可以發(fā)現，同一亞組中的各基因具有類似的基因結構，這些相似度極高的序列與基因組進化過程中的串聯重復、隨機重復與插入等現象有關，發(fā)生在各亞家族分化之后，在基因家族的進化和擴充過程中起到重要作用[27]。雷蒙德氏棉為現有四倍體栽培棉品種的 D組染色體祖先，研究HSP70基因的多次復制現象可以幫助人們更好地了解棉花基因組多倍化的形成過程。

雷蒙德氏棉的基因組經歷了全基因組重復、染色體重排和串聯重復等復雜的進化過程[5]。本研究結果表明，染色體大片段復制和串聯重復在 HSP70基因家族的擴增中起到重要作用。在雷蒙德氏棉中共有22個HSP70基因形成9個基因對，其中線粒體型 HSP70基因的擴增方式為串聯重復，質體型HSP70亞組的擴增為染色體復制形成的，胞質型和內質網型HSP70基因的擴增為串聯重復和染色體片段復制的共同產物。從棉纖維發(fā)育不同時期的表達數據來看，這些由同一基因祖先擴增而來的基因對，并不具有相似的表達模式，說明在進化過程中其表達特性發(fā)生趨異分化現象。

雷蒙德氏棉全基因組測序的結果表明，雙子葉植物可可與棉花的親緣關系較近[4]。單個基因家族HSP70的研究結果同樣表明，可可和棉花具有較近的親緣關系。將棉花、水稻、擬南芥、可可、二柄短尾草、萊茵衣藻等9個HSP70基因家族進行系統(tǒng)發(fā)生分析，發(fā)現HSP70不同亞組的分化發(fā)生在單細胞藻類植物形成之前。本文所列舉的 9種代表植物中均具有HSP70家族全部的亞組種類，這與所報道的HSP70基因家族從原核生物到真核生物都高度保守的特征相吻合[27,28]。所列各物種的HSP70基因家族成員個數并不與基因組大小完全成正比，說明HSP70基因在各物種中的進化和復制具有多樣性。眾所周知，多倍體化在陸生植物的進化過程中多次發(fā)生，并且這些多倍體事件對植物基因家族的擴充起到了重要作用。HSP70基因家族從單細胞萊茵衣藻的8個成員擴充到二穗短柄草的33個成員有可能是多倍體事件的產物。Blanc和Wolfe在擬南芥中發(fā)現胞質類蛋白質比細胞器特異性蛋白質更容易保留復制形成的新成員[29]。這一結論也適用于本文列舉的9種植物的HSP70基因家族進化情況。在陸生植物的漫長進化過程中，細胞器特異性的HSP70保持著相對穩(wěn)定的數量，而胞質型HSP70則在各物種進化的選擇壓力下發(fā)生了不同程度的多倍化[20]。胞質HSP70是重要的熱激誘導表達基因，對生物體的耐熱性具有重要作用。關于果蠅(Drosophila melanogaster)多拷貝胞質HSP70對其適應高溫脅迫的作用已進行了深入的研究[30,31]。相比于萊茵衣藻(2個胞質HSP70)，推測裸子和被子植物中數量較多的胞質HSP70可以提高陸生植物的耐熱性。

近年來，對植物HSP70功能的研究增多。目前已從擬南芥、煙草(Nicotiana tabacum L.)、玉米(Zea mays)等植物中獲得了多個該家族成員，發(fā)現HSP70基因在植物細胞中主要起到分子伴侶功能，除參與新生肽鏈的折疊、損傷蛋白的降解外，還負責一些前體蛋白向葉綠體[32]、內質網和線粒體[33]的轉運。May等[34]及惠穎等[35]在研究可能在棉花纖維起始和伸長發(fā)育階段起調控作用的14-3-3蛋白質時，發(fā)現葉綠體HSP70蛋白(gi|297734242)與14-3-3蛋白互作，二者結合形成復合體共同協(xié)調葉綠體或線粒體蛋白質的跨膜運輸，該HSP70蛋白與本文中GrHSP70-21同源性最高。Pang等[36]在對10 dpa的野生型陸地棉和徐州 142無纖維突變體的胚珠進行比較蛋白質組學分析，分離到多個屬于 HSP70家族的蛋白(FJ415194；FJ415195；FJ415196；FJ415199)在野生型中表達量顯著高于無纖維突變體，這些基因序列分別與 GrHSP70-13、GrHSP70-1、GrHSP70-20、GrHSP70-22具有較高同源性。由此，推測一些HSP70基因家族成員在棉纖維的發(fā)育過程中對蛋白質合成和運輸起到調控作用，當這些基因表達表達下調時，會影響棉纖維的正常發(fā)育，導致短絨或無纖維。

本文對雷蒙德氏棉HSP70家族在陸地棉TM-1中的同源基因進行表達分析，發(fā)現大量HSP70基因廣泛參與到棉纖維發(fā)育這一復雜的生理過程中。在纖維發(fā)育的不同時期，特異性表達的HSP70基因各不相同，在起始階段表達量高的HSP70基因可能涉及到纖維原始細胞的分化和突起過程，在中期表達量顯著的基因與其他基因協(xié)同作用，促進纖維初生壁伸長和次生壁增厚，而在后期表達量上升的HSP70基因則協(xié)助細胞脫水成熟。本文利用深度測序數據對HSP70家族基因在棉纖維發(fā)育過程中的作用進行了初步探索，而其如何參與每一發(fā)育過程的分子調控機制還需要進一步的研究。

[1] Xu ZY, Kohel RJ, Song GL, Cho J, Alabady M, Yu J, Koo P, Chu J, Yu SX, Wilkins TA, Zhu YX,Yu JZ. Gene-rich islands for fiber development in the cotton genome. Genomics, 2008, 92(3): 173-183.

[2] Ferguson DL, Turley RB, Triplett BA, Meredith WR. Comparison of protein profiles during cotton (Gossypium hirsutum L.) fiber cell development with partial sequences of two proteins. J Agric Food Chem, 1996, 44(12): 4022-4027.

[3] 張輝, 湯文開, 譚新, 龔路路, 李學寶. 棉纖維發(fā)育及其相關基因表達調控研究進展. 植物學通報, 2007, 24(2): 127-133.

[4] Wang KB, Wang ZW, Li FG, Ye WW, Wang JY, Song GL, Yue Z, Cong L, Shang HH, Zhu SL, Li Q, Yuan YL, Lu CR, Wei HL, Gou CY, Zheng ZQ, Yin Y, Zhang XY, Liu K, Wang B, Song C, Shi N, Kohe RJ, Percy RG, Yu JZ, Zhu YX, Wang J, Yu SX. The draft genome of a diploid cottonGossypium raimondii. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1098-1103.

[5] Lin LF, Pierce GJ, Bowers JE, Estill JC, Compton RO, Rainville LK, Kim C, Lemke C, Rong JK, Tang HB, Wang XY, Braidotti M, Chen AH, Chicola K, Collura K, Epps E, Golser W, Grover C, Ingles J, Karunakaran S, Kudrna D, Olive J, Tabassum N, Um E, Wissotski M, Yu Y, Zuccolo A, ur Rahman M, Peterson DG, Wing RA, Wendel JF, Paterson AH. A draft physical map of a D-genome cotton species (Gossypium raimondii). BMC Genomics, 2010, 11(1): 395.

[6] Paterson AH, Wendel JF, Gundlach H, Guo H, Jenkins J, Jin D, Llewellyn D, Showmaker KC, Shu S, Udall J, Yoo MJ, Byers R, Chen W, Doron-Faigenboim A, Duke MV, Gong L, Grimwood J, Grover C, Grupp K, Hu G, Lee TH, Li J, Lin L, Liu T, Marler BS, Page JT, Roberts AW, Romanel E, Sanders WS, Szadkowski E, Tan X, Tang H, Xu C, Wang J, Wang Z, Zhang D, Zhang L, Ashrafi H, Bedon F, Bowers JE, Brubaker CL, Chee PW, Das S, Gingle AR, Haigler CH, Harker D, Hoffmann LV, Hovav R, Jones DC, Lemke C, Mansoor S, ur Rahman M, Rainville LN, Rambani A, Reddy UK, Rong JK, Saranga Y, Scheffler BE, Scheffler JA, Stelly DM, Triplett BA, Van Deynze A, Vaslin MF, Waghmare VN, Walford SA, Wright RJ, Zaki EA, Zhang T, Dennis ES, Mayer KF, Peterson DG, Rokhsar DS, Wang X, Schmutz J. Repeated polyploidization of Gossypium genomes and the evolution of spinnable cotton fibres. Nature, 2012, 492(7429): 423-427.

[7] Large AT, Goldberg MD, Lund PA. Chaperones and protein folding in the archaea. Biochem Soc Trans, 2009, 37(Pt 1): 46-51.

[8] Parsell DA, Lindquist S. The function of heat shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Annu Rev Biochem, 1993, 27(1): 437-496.

[9] Kiang JG, Tsokos GC. Heat shock protein 70 kDa: molecular biology, biochemistry, and physiology. Pharmacol Ther, 1998, 80(2): 183-201.

[10] Bukau B, Weissman J, Horwich A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell, 2006, 125(3): 443-451.

[11] Dragovic Z, Broadley SA, Shomura Y, Bracher A, Hartl FU. Molecular chaperones of the Hsp110 family act as nucleotide exchange factors of Hsp70s. EMBO J, 2006, 25(11): 2519-2528.

[12] Liu QL, Hendrickson WA. Insights into Hsp70 chaperone activity from a crystal structure of the yeast Hsp110 Sse1. Cell, 2007, 131(1): 106-120.

[13] Lin BL, Wang JS, Liu HC, Chen RW, Meyer Y, Barakat A, Delseny M. Genomic analysis of the Hsp70 superfamily in Arabidopsis thaliana. Cell Stress Chaperones, 2001, 6(3): 201-208.

[14] Guy CL, Li QB. The organization and evolution of the spinach stress 70 molecular chaperone gene family. Plant Cell, 1998, 10(4): 539-556.

[15] Sarkar NK, Kundnani P, Grover A. Functional analysis of Hsp70 superfamily proteins of rice (Oryza sativa). Cell Stress Chaperones, 2013, 18(4): 427-437.

[16] Sung DY, Kaplan F, Guy CL. Plant Hsp70 molecular chaperones: protein structure, gene family, expression and function. Physiol Plant, 2002, 113(4): 443-451.

[17] No?l LD, Cagna G, Stuttmann J, Wirthmüller L, Betsuyaku S, Witte CP, Bhat R, Pochon N, Colby T, Parker JE. Interaction between SGT1 and cytosolic/nuclear HSC70 chaperones regulates Arabidopsis immune responses. Plant Cell, 2007, 19(12): 4061-4076.

[18] 朱一超, 張?zhí)煺? 賀亞軍, 郭旺珍. 棉花纖維伸長發(fā)育期的基因表達分析. 作物學報, 2006, 32(11): 1656-1662.

[19] Zhao PM, Wang LL, Han LB, Wang J, Yao Y, Wang HY, Du XM, Luo YM, Xia GX. Proteomic identification of differentially expressed proteins in the Ligon lintless mutant of upland cotton (Gossypium hirsutum L.). J Proteome Res, 2009, 9(2): 1076-1087.

[20] Renner T, Waters ER. Comparative genomic analysis of the Hsp70s from five diverse photosynthetic eukaryotes. Cell Stress Chaperones, 2007, 12(2): 172.

[21] Maher C, Stein L, Ware D. Evolution of Arabidopsis microRNA families through duplication events. Genome Res, 2006, 16(4): 510-519.

[22] Wang YP, Tang HB, Debarry JD, Tan X, Li JP, Wang XY, Lee TH, Jin HZ, Marler B, Guo H, Kissinger JC, Paterson AH. MCScanX: a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity. Nucleic Acids Res, 2012, 40(7): e49.

[23] Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4. 0. Mol Biol Evol, 2007, 24(8): 1596-1599.

[24] 胡根海, 喻樹迅. 利用改良的 CTAB 法提取棉花葉片總RNA. 棉花學報, 2007, 19(1): 69-70.

[25] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[26] Cannon SB, Mitra A, Baumgarten A, Young ND, May G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol, 2004, 4: 10.

[27] Hu WH, Hu GC, Han B. Genome-wide survey and expression profiling of heat shock proteins and heat shockfactors revealed overlapped and stress specific response under abiotic stresses in rice. Plant Science, 2009, 176(4): 583-590.

[28] Bukau B, Horwich AL, Cycles H. The Hsp70 and Hsp60 review chaperone machines. Cell, 1998, 92(3): 351-366.

[29] Blanc G, Wolfe KH. Functional divergence of duplicated genes formed by polyploidy during Arabidopsis evolution. Plant Cell, 2004, 16(7): 1679-1691.

[30] Lerman DN, Feder ME. Naturally occurring transposable elements disrupt hsp70 promoter function in Drosophila melanogaster. Mol Biol Evol, 2005, 22(3): 776-783.

[31] Garbuz D, Evgenev MB, Feder ME, Zatsepina OG. Evolution of thermotolerance and the heat-shock response: evidence from inter/intraspecific comparison and interspecific hybridization in the virilis species group of Drosophila. I. Thermal phenotype. J Exp Biol, 2003, 206(14): 2399-2408.

[32] Waegemann K, Paulsen H, Soll J. Translocation of proteins into isolated chloroplasts requires cytosolic factors to obtain import competence. FEBS Letters, 1990, 261(1): 89-92.

[33] Deshaies RJ, Koch BD, Werner-Washburne M, Craig EA, Schekman R. A subfamily of stress proteins facilitates translocation of secretory and mitochondrial precursor polypeptides. Nature, 1988, 332(6167): 800-805.

[34] May T, Soll J. 14-3-3 proteins form a guidance complex with chloroplast precursor proteins in plants. Plant Cell, 2000, 12(1): 53-63.

[35] 惠穎, 王晉, 孫敬, 劉康, 唐燦明. 棉花Gh14-3-3L2 基因的分子克隆及其互作蛋白質的初步鑒定. 棉花學報, 2012, 24(4): 285-292.

[36] Pang CY, Wang H, Pang Y, Xu C, Jiao Y, Qin YM, Western TL, Yu SX, Zhu YX. Comparative proteomics indicates that biosynthesis of pectic precursors is important for cotton fiber and Arabidopsis root hair elongation. Mol Cell Proteomics, 2010, 9(9): 2019-2033.

(責任編委: 劉 寶)

Genome-wide analysis of HSP70 superfamily in Gossypium raimondii and the expression of orthologs in Gossypium hirsutum

Yuting Zhang1,2, Minhua Wang1,2, Jiadong Chen2, Junkang Rong2,3, Mingquan Ding2,3

1. The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Lin’an 311300, China;
2. The Key Laboratory for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang Province, School of Agriculture and Food Science, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Lin’an 311300, China;
3.Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, China

Heat shock 70 (HSP70) proteins are highly conserved molecular chaperones widely existed in the plant kingdomwhich are involved in cellular protein folding process. In this study, comprehensive evolutionary analyses of the Gossypium raimondii HSP70 gene family members are conducted and 30 HSP70 genes are identified. The gene structure, chromosome distribution, gene duplication and phylogenic evolution of this family are further analyzed. The results reveal that HSP70 family genes can be clustered into several major subgroups based on their sub-cellular locations, and the gene structures are relatively conserved in each subgroup. Both tandem duplications and chromosome segmental duplications are found to contribute to the expansion of HSP70 gene family. Evolutionary analysis of HSP70s in diverse species reveals that the differentiation of HSP70 subgroups occurred before the multi-cell and single-cell differentiation, with the cytoplasmic HSP70s multiple amplified. The expression pattern of HSP70 genes under series of fiber development stages indicates that many HSP70 genes may participate in fiber development processes including fiber initiation and elongation. This study provides the complete profiles of cotton HSP70 family genes for future study on their functions related to the molecular mechanisms of fiber development.

cotton fiber; HSP70 family; deep sequencing; gene structure; phylogenic analysis

2014-03-11;

2014-05-20

國家高技術研究發(fā)展計劃項目(863計劃)(編號：2011AA100202)，國家自然科學基金項目(編號： 31200909)，浙江省自然科學基金項目(編號： LQ12C06002)和棉花生物學國家重點實驗室開放課題(編號：CB2013A02，CB2014B04)資助

張毓婷，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：棉花遺傳與分子育種。E-mail：zhangyutingly@126.com

丁明全，講師，研究方向：棉花遺傳與分子育種。E-mail：mqding@bjfu.edu.cn

戎均康，教授，研究方向：棉花遺傳與分子育種。E-mail：jkrong@yahoo.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0921

時間: 2014-7-31 15:10:03

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140731.1510.001.html