同一藥物不同劑量足三里穴位注射對心氣虛證的效應對比研究

趙興梅，王 燕，陳華德

（浙江中醫(yī)藥大學，杭州 310053）

同一藥物不同劑量足三里穴位注射對心氣虛證的效應對比研究

趙興梅1，王 燕2，陳華德1

（浙江中醫(yī)藥大學，杭州 310053）

目的研究參芪扶正注射液足三里穴位注射對心氣虛證的效應與用藥劑量的關系。方法通過負重游泳及灌服大劑量心得安法獲得心氣虛證大鼠模型，對各治療組分別進行不同劑量參芪扶正注射液的足三里穴注治療。連續(xù)治療10d后，觀察并記錄大鼠的一般狀況和癥狀；通過ELISA法檢測各組血清心鈉素（ANP）及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量；通過比色法檢測各組血清超氧化物歧化酶（SOD）活性；通過HE染色法檢測各組心肌組織病理改變。結(jié)果和正常對照組相比，模型對照組出現(xiàn)疲軟無力，舌質(zhì)發(fā)紫，呼吸急促等明顯的心氣虛癥狀；血清ANP濃度升高，cAMP濃度降低，SOD活性降低，均具有極其顯著性意義（P＜0.001）；心肌組織病理示：炎細胞浸潤明顯，心肌細胞嚴重水腫，排列紊亂。和模型組相比，各治療組癥狀緩解，血清ANP濃度降低，cAMP濃度升高、SOD活性增強，差異均具有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），其中參芪0.05mL組變化最?。≒＜0.05），參芪0.20mL組變化最大（P＜0.001）；心肌組織病理改變減輕，其中參芪0.20mL組最接近正常。結(jié)論參芪扶正注射液足三里穴位注射能有效治療心氣虛證，且其療效與用藥劑量在一定劑量范圍（0.05～0.20）mL內(nèi)成正相關。

穴位注射；足三里穴；心氣虛證；參芪扶正注射液；給藥劑量；效應；對比研究

心氣虛證為臨床常見證型，出現(xiàn)于多種疾?。ㄈ缧呐K病、腫瘤、高血壓、糖尿病、腎病等）的病程中，如不及時治療，將會進一步出現(xiàn)心血虛、心陽虛，甚至氣虛血瘀、水濕內(nèi)停、陰陽兩虛、心脈痹阻等，導致心臟出現(xiàn)不可逆的損害，嚴重威脅生命。穴位注射以經(jīng)絡學說為指導，將經(jīng)絡、腧穴、藥物效應有機結(jié)合起來，療效顯著，常常治療疾病起到事半功倍的效果。大量臨床和實驗研究證實，穴位注射產(chǎn)生的藥效優(yōu)于口服、肌注，甚至接近或超過靜脈給藥［1］。但目前對穴位注射治療心氣虛證的效應相關影響因素尚缺乏系統(tǒng)的研究和梳理。因此，設計本實驗來探討穴位注射法對心氣虛證的療效與用藥劑量之間的量效關系，為心氣虛證的臨床治療提供新的方法指導和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物：Wistar大鼠60只，雄性，體重為（200士20）g，6周齡。由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供（購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）：2008-0016）。實驗用藥：心得安片劑（江蘇常州康普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1202004）參芪扶正注射液（麗珠集團利民制藥廠生產(chǎn)，批號：1202096）。實驗工具：1mL注射器（4.5號針頭）。購自浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院。試劑盒：超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號：KGT001100）。大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（武漢華美生物工程有限公司生產(chǎn)，編號：CSB-E07298r）。大鼠心鈉肽（ANP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒。（武漢華美生物工程有限公司生產(chǎn)，編號：CSB-E12982r）。

主要儀器：MR-4100型酶標儀，美國Dynatech公司。HM 335E型輪轉(zhuǎn)切片機（德國MICROM）；AP280組織包埋機（德國Microm）；ST5010染色機（德國Leica）；STP120組織脫水機（德國Microm）；80I相差顯微鏡（德國Nikon）。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模：實驗前先進行動物游泳適應能力的篩選：雄性Wistar大鼠60只，每天在游泳缸里強迫負重游泳2次，每次游至力竭（翻正反射消失）。連續(xù)3d后淘汰無法適應游泳的大鼠（淘汰率約3％），從剩余大鼠中隨機選出8只大鼠作為正常對照組。其余大鼠繼續(xù)造模，實驗20d后，隨機選出48只，第21天起每日灌服心得安溶液2.4mg/100g體重，連續(xù)4d。通過指標檢測驗證造模成功（參照王碩仁等提出的心氣虛證動物模型評價方法［2］）后，隨機分為6組（每組8只）：分別為5個治療組（0.05mL組、0.10mL組、0.15mL組、0.20mL組、0.25mL組），模型對照組。

1.2.2 造模成功后，各組處理如下：治療組：穴位：選取雙側(cè)足三里穴。穴位定位參考李忠仁主編的《實驗針灸學》［3］。手法：補法，即順著經(jīng)絡循行的方向緩慢注射，注射時間為1min。藥物：參芪扶正注射液。給藥劑量：分別為每只大鼠每穴0.05ml、0.10mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL（根據(jù)人與動物之劑量換算公式算出：一般控制在每100g體重注射藥液0.1mL左右，且穴位對藥物的吸收較為敏感，故設了以上不同給藥劑量）。

模型對照組：造模后不做任何處理。

正常對照組：常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水，不予任何處理。

各組按如上處理，1次/d，連續(xù)10d后，抽血檢測相關指標并取大鼠心肌組織進行病理切片檢測。

1.3 指標檢測

1.3.1 行為學指標：觀察并記錄各組大鼠的行為學變化。

1.3.2 用ELISA法測定各組血清（EDTA抗凝）ANP和cAMP的濃度。具體操作分別按大鼠心鈉肽（ANP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒和大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進行。

1.3.3 通過比色法檢測各組血清SOD活性：具體操作按超氧化物歧化酶（SOD）測試盒說明書進行。

1.3.4 用HE染色法檢測各組大鼠心肌組織病理改變。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包對相關數(shù)據(jù)進行處理。所有數(shù)據(jù)以平均值士標準差（±s）表示，各組組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 一般情況和癥狀（表1）

2.2 各組血清ANP和cAMP濃度以及SOD活性

通過ELISA實驗測得各組血清ANP、cAMP濃度以及SOD活力（表2）所示：模型組與正常組對比，P＜0.001，表示差異有極其顯著性，說明造模成功。與模型對照組相比，①各治療組血清ANP濃度均降低。0.05mL組差異有顯著性（P＜0.05），0.10mL組、0.15mL組、0.25mL組差異有非常顯著性（P＜0.01），0.20mL組差異有極其顯著性（P＜0.001）。說明通過穴位注射參芪扶正注射液可降低血清ANP濃度，且在0.05mL～0.20mL的劑量范圍內(nèi)存在量效關系。②各治療組cAMP濃度均升高，0.05mL組的cAMP濃度升高，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各給藥組的cAMP濃度均明顯升高，0.10mL組和0.15mL組差異有顯著性（P＜0.05），0.20mL組和0.25mL組差異有非常顯著性（P＜0.01）。說明通過穴位注射參芪扶正注射液可提高血清cAMP濃度，且在0.05mL～0.20mL的劑量范圍內(nèi)存在量效關系。③各治療組SOD活力均增加。0.05mL組和0.10mL組差異有顯著性（P＜0.05），0.15mL組和0.25mL組差異有非常顯著性（P＜0.01），0.20mL組差異有極其顯著性（P＜0.001）。說明通過穴位注射參芪扶正注射液可增強血清SOD活性，且在0.05mL～0.20mL的給藥范圍內(nèi)存在量效關系。

表1 治療前后大鼠一般狀況觀察Tab.1 Comparison of general conditions and symptoms in each group before and after treatment

表2 治療后各組血清ANP和cAMP濃度以及SOD活力的對比（±s，n=8）Tab.2 Comparison of the concentrations of serum ANP and cAMP as well as the activity of SOD in each group after treatment（±s，n=8）

表2 治療后各組血清ANP和cAMP濃度以及SOD活力的對比（±s，n=8）Tab.2 Comparison of the concentrations of serum ANP and cAMP as well as the activity of SOD in each group after treatment（±s，n=8）

注：與正常對照組比較▲▲▲P＜0.001；與模型對照組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001。Note：▲▲▲P＜0.001 vs.control；*P＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊P＜0.001 vs.model.

組別Groups血清心鈉素濃度（pg/mL） Concentration of ANP（pg/mL）環(huán)磷酸腺苷濃度（pmol/mL） Concentration of cAMP（pmol/mL）總超氧化物歧化酶活力（U/mL） T-SOD activity（U/mL） 0.05mL組 274.595±29.350* 0.879±0.219 179.912±16.343* 0.10mL組 262.107±27.922＊＊ 0.996±0.250* 181.008±21.738* 0.15mL組 260.341±20.715＊＊ 1.084±0.336* 192.281±27.752＊＊0.20mL組 230.040±17.772＊＊＊ 1.183±0.264＊＊ 206.740±30.129＊＊＊0.25mL組 242.600±32.696＊＊ 1.141±0.329＊＊ 200.759±30.839＊＊模型對照組 Model 290.972±13.675▲▲▲ 0.628±0.304▲▲▲ 145.649±18.762▲▲▲正常對照組 Control 199.365±31.333 1.389±0.382 220.192±25.725

2.3 各組病理切片

采用HE染色法檢測各組心肌病理切片，結(jié)果所示：模型對照組與正常組相比：肌細胞水腫、排列紊亂，有炎細胞浸潤，說明造模成功。和模型對照組相比，0.05mL組和0.10mL組肌細胞水腫明顯、排列紊亂；0.15mL組和0.25mL組肌細胞水腫減輕，排列趨于整齊，但有少量炎細胞浸潤；0.20mL組肌細胞排列整齊，肌細胞水腫明顯減輕，無炎細胞浸潤（圖1，見彩插）。

3 討論

心氣虛證由心氣虧虛所致，臨床以心悸、自汗、口唇發(fā)紺、氣短、胸悶、動則加重為主要臨床表現(xiàn)。其病機在于心主血脈，心氣虛則推動無力，導致全身氣血瘀滯，進而對全身各臟器產(chǎn)生不同程度的損害。目前中醫(yī)臨床除了通過益氣活血、養(yǎng)陰安神、溫陽利水的中藥配方進行治療外［4］，穴位注射作為兼具中西醫(yī)治療優(yōu)勢的一種特殊療法，也被廣泛應用于心氣虛證的治療。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，穴位注射參芪扶正注射液能顯著改善心功能且其療效與用藥劑量密切相關。

心鈉素即心房利鈉尿肽（ANP），由心房合成、貯存、分泌的一種多肽類激素，當右房壓升高時，心房肌張力增加，引起ANP的分泌增加。而慢性心力衰竭（CHF）是引起心房壓增高的主要原因。目前，普遍認為ANP的血漿濃度可在一定程度上反映CHF的嚴重程度。李莉等［5］通過測定40例正常人和6例心功能不全患者血漿ANP含量的變化，發(fā)現(xiàn)血漿ANP的濃度隨心功能分級的遞增而升高，與左室射血分數(shù)呈負相關。因而，認為血漿ANP含量可作為反映心功能狀態(tài)的指標之一，而且具有一定的定量意義。蔣梅先等［6］則進一步證明ANP血漿濃度的上升是CHF的標志。cAMP被稱為細胞內(nèi)的第二信使，可調(diào)節(jié)細胞的物質(zhì)代謝和生理活動，心肌細胞受損時，血漿cAMP濃度降低，而血漿cAMP濃度的增加可反映心肌代謝能力的改善。程志清等［7］認為ANP和cAMP均是評價CHF的可信指標。SOD是一種超氧化物歧化酶，又稱為超氧自由基清除因子和垃圾清道夫，它可以抗氧化抗衰老［8］，當心肌受損時?？蓪е耂OD活性降低［9］。SOD活性增加可反映心肌受損程度減輕。心氣虛時，導致氣虛型血瘀，氣虛水停［10］，進而引起心輸出量減少，冠脈血流量減少，心肌缺血缺氧，出現(xiàn)心肌細胞腫脹壞死，肌細胞排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤等病理改變。另外可能與SOD活性降低導致自由基堆積，引起的過氧化損傷有關。心肌病理改變逆轉(zhuǎn)是心功能恢復的基礎和前提。

本實驗研究顯示：和正常對照組相比，模型對照組大鼠出現(xiàn)疲軟無力，舌質(zhì)發(fā)紫，呼吸急促等明顯的心氣虛癥狀；血清ANP濃度升高，cAMP濃度降低，SOD活性降低，均具有極其顯著性意義（P＜0.001）；心肌組織病理顯示：炎細胞浸潤明顯，心肌細胞嚴重水腫，排列紊亂。說明本實驗造膜是成功的。和模型對照組相比，各治療組大鼠活力增加，舌質(zhì)變紅，毛發(fā)光滑，呼吸平穩(wěn)，心氣虛癥狀已得以緩解；血漿ANP濃度降低，cAMP濃度升高，SOD活性增強，其中0.05mL組改變最?。≒＞0.05或P＜0.05），0.20組改變最大（P＜0.001）；心肌組織病理改變減輕，其中參芪0.20mL組最接近正常。說明參芪扶正注射液足三里穴位注射對心氣虛證的效應與給藥劑量有關，用藥劑量不同，其療效不同。

綜上所述：參芪扶正注射液足三里穴位注射可有效治療心氣虛證。給藥劑量不同，其療效不同，且在一定的劑量范圍（0.05mL～0.20mL）內(nèi)，其療效與給藥劑量成正相關。因此，我們認為在運用穴位注射法治療心氣虛證時，一定要根據(jù)病情，選取藥物的最佳劑量，方能取得最佳治療效果。

［1］徐偉輝，陽仁達，李銳.不同途徑注射西地蘭對急性心衰家兔血流動力學影響的比較研究［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2010，16（6）：487-489.

［2］王碩仁，王振濤，趙明鏡，李敏.心氣虛病證動物模型及其評價體系的構(gòu)建［J］.中國實驗動物學報，2002，10（1）：33-38.

［3］李忠仁.實驗針灸學［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：327-328.

［4］李俊蘭.中醫(yī)辨證論治慢性心力衰竭的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2009，15（20）：3160-3163.

［5］李莉.心功能不全與血漿心鈉素水平的關系［J］.華西醫(yī)學，2000，15（2）：239-240.

［6］蔣梅先.心腎同病等病機與充血性心力衰竭循環(huán)激素的關系［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2000，14（1）：27-29.

［7］程志清，姚立，唐燁霞，等.心氣虛證復合因素造模法對Wistar大鼠基因表達的影響［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2006，30（20）：165-173.

［8］艾秀峰，陳民利，潘永明，等.D-半乳糖致衰老模型大鼠肝腎功能和自由基代謝與中藥的干預作用［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2010，20（5）：41-45.

［9］唐燁霞.心氣虛大鼠自由基損傷及心肌超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.包頭醫(yī)學院學報，2009，25（2）122-123.

［10］范素勤.養(yǎng)心活血法配合綜合調(diào)理治療心力衰竭68例［J］.陜西中醫(yī)，2011，32（10）：1281-1282.

Comparative study on the effects of a Chinese medicine Shenqi-fuzheng injection in different doses injected into Zusanli acupoint（ST36）on the treatment for heart-qi deficiency syndrome in rats

ZHAO Xing-mei1，WANG Yan2，CHEN Hua-de1
（Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

ObjectiveTo study the effects of Shenqi-fuzheng injection（SQ）in different doses injected into Zusanli acupoint in treating heart-qi deficiency syndrome and explore its dose-to-effet relationship.MethodsThe rat model of heart-qi deficiency syndrome was established by forced burden swimming and gavage of large doses of propranlolum.Seven groups of rats were set up with 8 rats in each group：the blank control group，the model group and 5 treatment groups which

a Chinese medicine Shenqi-fuzheng injection（SQ）in different doses（0.05mL，0.10mL，0.15mL，0.20mL and 0.25mL per rat，respectively）at ST36 acupoints.The treatment was administered for consecutive 10 days.The general conditions and symptoms of the rats were observed and recorded.The serum concentrations of atrial natriureticpeptide（ANP）and cyclic adenosine monophosphate（cAMP）were assayed by ELISA.The activity of serum superoxide dismutase（SOD）was detected by colorimetry.The pathological changes of myocardial tissue were observed using HE staining.ResultsCompared with the blank control group，the model group showed obvious heart failure symptoms such as fatigue，purple tongue，short and rapid breath，the concentration of ANP was increased while cAMP decreased，and SOD activity was declined（P＜0.001 for all）.The pathology of myocardial tissue showed inflammatory cell infiltration and seriously swollen cardiomyocytes in disordered arrangement.Compared with the model group，all treatment groups showed that symptoms were relieved，ANP concentration was decreased，and cAMP concentration and SOD activity were increased.Among them，the changes of indicators in the SQ-0.05mL group were mildest（P＜0.05）while strongest in the SQ-0.20mL group（P＜0.001）.The pathological changes of myocardial tissue in the SQ-0.20mL group were mildest and close to normal.ConclusionsST36 acupoint injection with the Chinese medicine Shenqi-fuzheng injection is an effective therapy for heart-qi deficiency syndrome in rats.The treatment effects are positively correlated with the doses of drug in the range of from 0.05mL to 0.20mL per rat.

Acupoint injection；Zusanli acupoint，ST36；Heart-qi deficiency syndrom；Chinese medicine Shenqifuzheng injection；administration doses；Therapeutic effect；Wistar rats；Comparative study

R33

A

1671-7856（2014）02-0038-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.009

浙江省自然科學資助項目（No：Y211118）。

趙興梅（1985-），女，浙江中醫(yī)藥大學在讀博士，專業(yè)：中醫(yī)內(nèi)科學，E-mail：87738431@qq.com。

陳華德（1957-），男，醫(yī)學博士，教授、博士生導師、主任中醫(yī)師，E-mail：docchd@sina.com。

2013-12-11