兔VX2肝癌模型制作改良及影像學(xué)評(píng)價(jià)

杜 童，韓 琳，牛洪欣，張西坤

（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，濟(jì)南 250031）

兔VX2肝癌模型制作改良及影像學(xué)評(píng)價(jià)

杜 童，韓 琳，牛洪欣，張西坤

（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，濟(jì)南 250031）

目的對(duì)兔VX2肝癌模型制作進(jìn)行改良，以用于介入治療學(xué)研究，同時(shí)探討瘤灶的CT表現(xiàn)及CT在檢測(cè)瘤灶中的作用。方法將VX2瘤細(xì)胞接種于兔皮下使其成瘤并傳代；新西蘭兔24只，以改良嵌插法建立移植性肝癌模型，于建模后7、14、21d分別行超聲、CT及血管造影檢查，用于檢測(cè)兔肝VX2瘤灶，評(píng)估瘤灶生長(zhǎng)變化；隨后處死動(dòng)物，進(jìn)行尸解，評(píng)估影像檢查結(jié)果。結(jié)果24只（100％）動(dòng)物以改良嵌插法建立移植性肝癌模型全部成功。瘤灶以種植后2周CT顯示最清楚和典型，直徑1cm～2cm左右，平掃呈低密度或等密度，動(dòng)脈早期明顯強(qiáng)化，門脈期呈低密度，與周圍肝組織分界較清楚。肝動(dòng)脈造影顯示腫瘤富血供。而種植后超過3周的腫瘤大部分發(fā)生壞死。結(jié)論嵌插改良法是一種值得推廣的建立移植性肝癌模型的方法；在對(duì)瘤灶進(jìn)行影像學(xué)評(píng)價(jià)上應(yīng)盡量選擇CT檢查，接種后1周左右的瘤灶較小而難以觀察；2周左右呈肝動(dòng)脈源性血供豐富的約1cm～2cm的實(shí)體瘤，造影征像為腫瘤血管與腫瘤染色；3周以上瘤灶大多出現(xiàn)明顯示壞死；因此對(duì)1～2cm大小的兔VX2肝癌瘤體，最適合行血管造影檢查。

VX2腫瘤；肝癌模型；兔；CT；血管造影

原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病隱匿，臨床發(fā)現(xiàn)往往已到晚期。近年來，隨著肝癌實(shí)踐的不斷深入［1］，人們認(rèn)識(shí)到其間存在著許多基礎(chǔ)理論和臨床問題，必須通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)和解決，而其中很多研究是利用動(dòng)物肝癌模型進(jìn)行的。兔VX2肝癌模型是目前理想的肝癌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，被廣泛用于肝癌腫瘤發(fā)生學(xué)、治療學(xué)、放射生物學(xué)、抗腫瘤藥物藥代動(dòng)力學(xué)及腫瘤影像學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究。但我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，制作該模型時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)移植瘤處肝表面及臨近腹壁發(fā)生轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中對(duì)兔VX2肝癌模型的制作方法做了一些探索和改良，并就其影像學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、瘤株及主要設(shè)備

6～8月齡普通級(jí)新西蘭兔24只，體重2.0kg～2.5kg，雌雄不限，購(gòu)自山東省農(nóng)科院（許可證號(hào)SCXK20090013）。VX2瘤細(xì)胞株由美國(guó)引進(jìn)。日本阿洛卡超聲診斷儀、德國(guó)西門子產(chǎn)64排CT機(jī)、大C臂DSA，介入器械：3F微導(dǎo)管及微導(dǎo)絲、自制股動(dòng)脈導(dǎo)管鞘等。無菌手術(shù)在山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及介入手術(shù)室進(jìn)行，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 兔VX2細(xì)胞株的制備

將活細(xì)胞密度為105～107個(gè)/mL的VX2瘤細(xì)胞懸液接種于兔大腿內(nèi)側(cè)近腹股溝部位皮下，使其成瘤并傳代，2周左右瘤體可長(zhǎng)至（1～2）cm3，手術(shù)取出傳代瘤株，將腫瘤包膜剝脫干凈，剔除壞死及纖維組織，取靠近邊緣的魚肉樣腫瘤組織在平皿上剪成約（1～2）mm3的小塊，以生理鹽水反復(fù)沖洗，作為瘤種備用。

1.3 瞼板腺囊腫鑷夾持固定瘤塊植入法即改良嵌插法［2］建立移植性肝癌模型

預(yù)接種兔經(jīng)耳緣靜脈先以安定（0.25mg/kg）靜脈注射，隨之氯胺酮（10mg/kg）麻醉后固定，劍突下正中倒v樣小弧型切口長(zhǎng)約1cm～2cm打開腹腔，剪除劍突，小拉鉤牽引暴露肝臟。選擇大小合適的瞼板腺囊腫鑷全層夾持肝葉（左中葉）并拖出腹腔外（圖1），力量以阻斷局部血液循環(huán)為度，不可用力過大而夾碎肝臟，調(diào)整好固定螺絲。在擬接種的手術(shù)部位以尖刀刺破肝包膜，深約3mm～5mm，將一瘤塊植入后以小塊明膠海綿封閉創(chuàng)口，壓迫片刻無滲血，表面涂以O(shè)B膠，稍后凝固即可撤出瞼板腺囊腫鑷，肝臟還納腹腔，兩層縫合切口。上述操作均在無菌條件下進(jìn)行，術(shù)后青霉素80萬單位肌內(nèi)注射，連續(xù)3d。

1.4 影像學(xué)評(píng)估和解剖觀察

術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)，種植后第1、2、3周分別隨機(jī)挑取8只實(shí)驗(yàn)兔逐只行超聲、CT及血管造影檢查，用于檢測(cè)兔肝VX2瘤灶，評(píng)估瘤灶生長(zhǎng)變化。隨后空氣栓塞法處死動(dòng)物，進(jìn)行尸解。具體做法：依前法先將兔麻醉，耳緣靜脈留置針不拔，以便隨時(shí)追加麻藥，腹部備皮。首先行普通超聲檢查。再行CT檢查，選用非離子型對(duì)比劑優(yōu)維顯（Ultravist，300mg/mL），對(duì)比劑量為7mL，0.3mL/s，先行肝臟CT平掃，延遲10s～12、40s～50s后分別行動(dòng)脈早期和門脈期增強(qiáng)掃描，掃描條件為120kV，180mA，F(xiàn)OV 160mm，層厚2mm，間距3mm。然后行血管造影（第2、3周），采用傳統(tǒng)Seldinger法：將實(shí)驗(yàn)兔固定后，腹股溝區(qū)備皮、消毒、鋪巾，靠近腹股溝區(qū)沿股動(dòng)脈縱行切開皮膚，暴露股動(dòng)脈鞘并小心剪開，分離出1～2cm長(zhǎng)的股動(dòng)脈，近遠(yuǎn)端分別用4號(hào)絲線穿過備用。提起近端絲線，保持適當(dāng)張力以暫時(shí)阻斷血流，用眼科剪在股動(dòng)脈前壁剪一小“v”形口，將短導(dǎo)絲插入，成功后將自制導(dǎo)管鞘順導(dǎo)絲插入股動(dòng)脈并向近端送入約4cm，結(jié)扎近端備用絲線以固定導(dǎo)管鞘。經(jīng)鞘管引入3F微導(dǎo)管，尋找到腹腔動(dòng)脈后行造影，確認(rèn)肝固有動(dòng)脈，超選擇性插管至肝固有動(dòng)脈，再次造影證實(shí)肝實(shí)質(zhì)顯影，并可進(jìn)一步超選擇肝左或肝右動(dòng)脈進(jìn)行造影［3-5］。最后是尸解，觀察肝臟成瘤情況、測(cè)量腫瘤直徑并與最后的CT檢查結(jié)果對(duì)比、瘤體內(nèi)部壞死情況、有無腹壁及其他器官轉(zhuǎn)移等。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)評(píng)估

建模術(shù)后1周：B超不能發(fā)現(xiàn)瘤灶；CT掃描，瘤體較小或者圖像上無法分辨瘤灶。術(shù)后2周：瘤體直徑可達(dá)1cm～2cm，圖像呈典型實(shí)體瘤表現(xiàn)，8只實(shí)驗(yàn)兔中B超發(fā)現(xiàn)6只（6/8），CT發(fā)現(xiàn)8只（8/8），B超診斷率低于CT（75％對(duì)100％）。術(shù)后3周：瘤體繼續(xù)增大，中央出現(xiàn)液化壞死，呈囊腔表現(xiàn)。B超及CT均能發(fā)現(xiàn)瘤灶，診斷率相當(dāng)（均100％）。

1cm～2cm大小的兔VX2肝癌瘤體，其CT表現(xiàn)與人肝細(xì)胞癌相似，平掃圖像呈邊界清楚的低密度結(jié)節(jié)，與周圍正常肝組織分界清楚，動(dòng)脈期明顯強(qiáng)化（圖2），因該時(shí)期造影征像為腫瘤血管與腫瘤染色，呈肝動(dòng)脈源性血供豐富的實(shí)體瘤，故此時(shí)最適合行血管造影檢查；而3周以上瘤灶中央大多出現(xiàn)明顯壞死，染色不明顯，因此不適合行血管造影檢查。

介入操作時(shí)除1只因麻醉淺致手術(shù)時(shí)掙扎，股動(dòng)脈近心端被導(dǎo)管鞘意外穿破，大出血死亡外，其余均成功插管至肝固有動(dòng)脈，部分可超選擇至肝左或肝右動(dòng)脈，插管成功率87.5％。行DSA造影后主要表現(xiàn)為：胃左與肝總動(dòng)脈共干，肝總動(dòng)脈向右走行分出胃十二指腸動(dòng)脈與肝固有動(dòng)脈，肝固有動(dòng)脈分為肝左與肝右動(dòng)脈，肝左動(dòng)脈較粗，肝右動(dòng)脈相對(duì)較細(xì)，膽囊動(dòng)脈主要由肝右動(dòng)脈分出。瘤周血管粗大紊亂，有大量細(xì)小的異常血管，腫瘤呈均一、結(jié)節(jié)樣或環(huán)行染色，瘤體較大時(shí)可見粗大的供瘤動(dòng)脈被瘤體推壓成“抱球狀”，其外周可見肝左動(dòng)脈分出的腫瘤滋養(yǎng)血管抵達(dá)腫瘤并繞行，密度高且粗大，其分支進(jìn)入腫瘤內(nèi)部（圖3）。

2.2 尸檢情況

24只實(shí)驗(yàn)兔全部種植成功（100％）。第1周時(shí)一部分瘤灶雖然影像學(xué)檢查未能檢出，但尸檢均發(fā)現(xiàn)移植瘤成活。瘤灶均位于肝左葉，呈單一團(tuán)塊狀（圖4），無肝表面及腹壁轉(zhuǎn)移。第3周時(shí)有2只發(fā)現(xiàn)肝表面及腹壁轉(zhuǎn)移，1只發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，1只合并有腹水。大體解剖：腫瘤組織呈灰白色結(jié)節(jié)樣，圓形或橢圓形，與周圍組織分界清楚，剖面呈魚肉狀。測(cè)量腫瘤直徑均與CT檢查結(jié)果相符。直徑2cm以下的瘤灶多呈實(shí)質(zhì)性，3周后的瘤灶直徑約2.5cm～3.5cm，中央多有液化性壞死灶并形成囊腔。

3 討論

圖1 瞼板腺囊腫鑷夾持肝葉并固定Fig.1 Exteriorizing and fixing the liver lobe，and clamped and compressed with a chalazion forceps.

圖2 VX2肝癌CT表現(xiàn)Fig.2 CT image of the VX2 hepatoma

圖3 DSA造影后瘤體呈“抱球狀”Fig.3 The tumor shows“holding a ball”after DSA angiography

圖4 肝左葉呈單一團(tuán)塊狀瘤體Fig.4 The tumor is a single mass and located in the middle left liver lobe

兔VX2腫瘤為從Shop病毒在兔皮膚誘發(fā)的鱗癌，經(jīng)數(shù)十次傳代建立的兔可移植性腫瘤，接種于肝內(nèi)的成功率極高，接種成功的肝VX2瘤灶是主要由肝動(dòng)脈供血的富血供性腫瘤，雖然其病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)并非肝細(xì)胞癌，但已有的研究證明其適合用作于肝癌介入治療的動(dòng)物模型。

VX2肝癌按接種所使用的瘤種形態(tài)可分為：①瘤細(xì)胞懸液接種，②瘤組織小塊接種；用于研究原發(fā)性肝癌的多用開腹直視下肝實(shí)質(zhì)瘤組織塊接種法，用于研究肝轉(zhuǎn)移瘤的多用經(jīng)門靜脈或脾臟瘤細(xì)胞懸液注入法。按接種的途徑可分為：①經(jīng)肝動(dòng)脈注入接種，②經(jīng)門靜脈或腸系膜靜脈注入接種，③肝實(shí)質(zhì)接種。肝實(shí)質(zhì)接種方法按手術(shù)方式可分為開腹直視下接種和利用影像學(xué)方法引導(dǎo)經(jīng)皮穿剌接種［6］。開腹直視下肝實(shí)質(zhì)接種法又含有開腹直視下肝穿剌注入瘤小塊與局部肝切開瘤小塊包埋法，都屬于嵌插法，不同之處在于植入瘤塊后有的是以明膠海綿塊填塞，有的是縫合肝被膜。以影像學(xué)方法引導(dǎo)經(jīng)皮穿剌接種法屬于微創(chuàng)技術(shù)，優(yōu)點(diǎn)是不需開腹，動(dòng)物創(chuàng)傷小，但易形成穿刺部位肝以外的轉(zhuǎn)移，且成功率低。

兔肝臟不易固定，血運(yùn)豐富，術(shù)中容易出血且不易止，致術(shù)野不清，操作困難，容易造成移植瘤播散，增加手術(shù)難度，我們使用瞼板腺囊腫鑷，取得了理想的效果。瞼板腺囊腫鑷是眼科的一種專用器械，分大、中、小三號(hào)。具體方法是在擬接種的手術(shù)部位（肝左兩葉呈疊瓦狀排列，選擇左中葉中央）以瞼板腺囊腫鑷全層夾持，力量以阻斷局部血液循環(huán)為度，調(diào)整好固定螺絲；瘤塊植入后，放置明膠海綿塊，再涂以O(shè)B膠，稍后凝固即可撤出瞼板腺囊腫鑷，其他步驟均常規(guī)操作。此法優(yōu)點(diǎn)是出血控制好，術(shù)野清除，操作方便，節(jié)省人力，不需助手，在整個(gè)瘤塊植入操作過程中不至于引起其他部位的轉(zhuǎn)移。而單純?nèi)髂z海綿在兔清醒后活動(dòng)或掙扎時(shí)，海綿塊往往會(huì)因?yàn)楦箟旱脑黾佣摮鰟?chuàng)口，使種植瘤長(zhǎng)到肝邊緣、腹壁或者形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，致使下步實(shí)驗(yàn)受影響。而經(jīng)皮穿剌接種法、開腹嵌插法等因有不可避免的肝出血以及瘤組織相對(duì)暴露等原因易形成肝表面、腹壁或者遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果表明，嵌插改良法是一種值得推廣的建立移植性肝癌模型的方法。

超聲檢查可用于兔肝VX2腫瘤的指導(dǎo)接種、生長(zhǎng)觀察、治療后動(dòng)態(tài)變化評(píng)估等。采用氟碳聲學(xué)造影劑和二次諧波顯像技術(shù)進(jìn)行肝臟腫瘤聲學(xué)造影可大大提高超聲對(duì)肝腫瘤的觀察能力，腫瘤血管早期增強(qiáng)，可以提高對(duì)大于1cm瘤灶的檢出。灌注-延遲顯像聲學(xué)造影對(duì)直徑5mm～10mm內(nèi)的腫瘤結(jié)節(jié)的檢出率可高達(dá)90％左右。

CT與MRI可用于檢測(cè)兔肝VX2瘤灶，評(píng)估瘤灶生長(zhǎng)變化。接種后1周左右的瘤灶較小而難以觀察，2周左右時(shí)表現(xiàn)典型，3周以上瘤灶大多出現(xiàn)明顯示壞死。VX2肝癌的CT/MRI表現(xiàn)與人肝細(xì)胞癌相似，CT平掃多呈邊界清楚的低密度結(jié)節(jié)，動(dòng)脈早期明顯強(qiáng)化，門靜脈期呈較低密度與周圍肝組織分界較清楚；MRI T1WI與T2WI分別表現(xiàn)為均勻低信號(hào)和稍高信號(hào)，增強(qiáng)后瘤灶呈邊緣環(huán)狀強(qiáng)化。

血管造影時(shí)，由于兔肝血管細(xì)小，所能容納造影劑的量很少，常規(guī)造影法不易觀察，現(xiàn)在大都采用DSA造影。兔VX2肝癌雖是移植性腫瘤，但血管造影顯示為肝動(dòng)脈源性血供豐富的實(shí)體瘤，主要征像為腫瘤血管與腫瘤染色［5，7］。在介入治療時(shí)，必須先行造影證實(shí)插管在肝固有動(dòng)脈內(nèi)，并盡量超選擇進(jìn)入肝動(dòng)脈分支，以避免化療栓塞時(shí)造成胃腸異位栓塞、膽囊栓塞、肝臟大面積梗死等嚴(yán)重后果。

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Improvement in the preparation of rabbit models bearing VX2 liver tumor for interventional therapy study and imaging evaluation

DU Tong，HAN Lin，NIU Hong-xin，ZhANG Xi-kun
（Department of General Surgery，Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences.Jinan 250031，China）

ObjectiveTo improve the preparation of rabbit models bearing VX2 hepatoma for interventional therapy study，and to investigate their CT features.MethodsEighty New Zealand white rabbits were implanted with VX2 hepatoma in the deep aspect of the left lobe of liver.CT scanning was performed in the experimental animals at 1，2 and 3 weeks after implantation.The plain，early arterial phase and portal phase images were obtained.ResultsTwenty-four（100％）rabbits were successfully implanted with VX2 hepatoma in the liver.On CT scans taken at 2 weeks after implantation，the tumors showed most clear and typical images：1-2 cm in diameter，hypodensity or isodensity on plain CT scans，markedly enhanced early arterial phase images，hypodensity on portal phase images，well discernible from the surrounding liver tissues.Hepatic angiography showed that the tumor was hypervascular.Necrosis was seen in most animals at 3 weeks after implantation.ConclusionsThe rabbit model bearing VX2 hepatoma is more suitable for interventional therapy study.CT is very useful in evaluating the tumors.

VX2 hepatoma；Liver cancer model；Rabbit；CT；Angiography

牛洪欣（1972-），男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤。E-mail：sdblache@126.com。

R33

A

1671-7856（2014）02-0029-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.007

山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院資助項(xiàng)目（編號(hào)：200944）。

杜童（1974-），女，主管護(hù)師，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：腫瘤外科護(hù)理。

2013-11-23