上皮組織特異性表達N-LMP1和CR2轉(zhuǎn)基因豬胚胎成纖維細胞的構(gòu)建與鑒定

黃海城，劉 歡，安 靚

（1.南方醫(yī)科大學腫瘤研究所，廣州 510515；2.深圳華大基因研究院，深圳 518083）

上皮組織特異性表達N-LMP1和CR2轉(zhuǎn)基因豬胚胎成纖維細胞的構(gòu)建與鑒定

黃海城1，劉 歡2，安 靚1

（1.南方醫(yī)科大學腫瘤研究所，廣州 510515；2.深圳華大基因研究院，深圳 518083）

目的構(gòu)建上皮組織特異性表達鼻咽癌來源潛伏膜蛋白1（N-LMP1）和人補體受體2（CR2）真核表達載體，轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細胞并篩選整合有N-LMP1和CR2基因的細胞克隆，為構(gòu)建與EBV感染相關(guān)的豬鼻咽癌模型奠定基礎(chǔ)。方法通過直接合成ED-L2啟動子和N-LMP1，從人B淋巴細胞中的RNA經(jīng)RT-PCR擴增出CR2，將上述3個片段逐個連接到真核表達載體pN1上，構(gòu)建上皮組織特異性表達N-LMP1和CR2的載體pN1-EDL2-N-LMP1-CR2；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細胞，經(jīng)藥物G418篩選和PCR鑒定陽性克隆。結(jié)果成功構(gòu)建上皮組織特異性表達N-LMP1和CR2的真核表達載體pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2，并成功整合到豬胚胎成纖維細胞的基因組中，獲得了整合有目的基因N-LMP1和CR2的豬胚胎成纖維細胞克隆。結(jié)論獲得了上皮組織特異性表達N-LMP1和CR2的豬胚胎成纖維細胞克隆，為通過細胞核移植方法獲得表達N-LMP1和CR2轉(zhuǎn)基因豬提供了供體細胞。

N-LMP1；CR2；豬胚胎成纖維細胞；鼻咽癌

鼻咽癌是中國最常見的頭頸部腫瘤之一，發(fā)病率逐年增長，具有明顯的地域性。在其多因素的發(fā)展過程中，遺傳易感性、EB病毒和環(huán)境因素被認為是主要原因。EBV是如何進入鼻咽部上皮細胞從而引發(fā)鼻咽癌的，至今仍未定論，但B淋巴細胞膜上的EB病毒受體己經(jīng)明確為CR2［1-3］，有關(guān)上皮細胞是否表達CR2至今仍有爭論，但己有多位研究者嘗試用不同的方法將CR2基因?qū)攵喾N細胞，所有研究均證實，在提高細胞內(nèi)CR2表達水平后，EBV可成功感染原不能感染的細胞，或能明顯提高細胞對EBV的感染率［4-7］。LMP1基因是EB病毒最可能的瘤基因，在鼻咽癌組織中獲得的LMP1（N-LMP1）基因不僅在DNA序列上與標準實驗株B95-8來源的LMP1（B-LMP1）存在明顯差異，而且在功能上與后者也不盡一致，特別是N-LMP1的致瘤能力明顯強于B-LMP1［8-10］。因此構(gòu)建EBV感染相關(guān)的豬鼻咽癌模型時，用N-LMP1就更具有針對性。選用特異性啟動子ED-L2構(gòu)建組織特異性表達目的基因的轉(zhuǎn)基因動物已成為一種較成熟的手段。Nakagawa，H.［3，11］曾利用ED-L2啟動子指導目的瘤基因CyclinD1在轉(zhuǎn)基因鼠舌頭、食道、前胃和皮膚組織特異性表達。藍柯曾用ED-L2啟動子調(diào)節(jié)鼻咽癌來源的LMP1建立轉(zhuǎn)基因小鼠，并觀察到LMP1基因在F0代小鼠鼻咽部出現(xiàn)了不典型增生病變［3，12］。從ED-L2的表達特性來看，它具有嗜上皮性，而且在鼻咽上皮的表達活性較高，因此，如果利用ED-L2構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，可望使目標基因在鼻咽上皮高水平表達。

豬在解剖、組織、生理和營養(yǎng)代謝、血液生化指標、疾病發(fā)生過程等方面與人類極為相近［13］，豬作為實驗動物的一個重要應(yīng)用是建立人類疾病模型，近年來，體細胞基因修飾技術(shù)、體細胞核移植技術(shù)的發(fā)展使得對豬等大動物進行高效的基因操作成為可能［14，15］。應(yīng)用該技術(shù)只需要對豬的體細胞進行基因修飾，而后通過體細胞核移植即可獲得可穩(wěn)定遺傳的基因修飾豬，此項技術(shù)的發(fā)展推進了豬作為人類疾病動物模型的研究。運用該技術(shù)，豬作為人類疾病動物模型已應(yīng)用在糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及人類異種器官移植等方面［16-20］，但在有關(guān)鼻咽癌方面尚未見報道。本實驗構(gòu)建了整合了N-LMP1和CR2基因的豬胚胎成纖維細胞，為制備鼻咽部高表達N-LMP1和CR2轉(zhuǎn)基因豬提供前提條件，為今后構(gòu)建與EBV感染相關(guān)的豬鼻咽癌模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和細胞

E.coli DH5α、質(zhì)粒pN1、第一個黃種人基因組測序所使用的炎黃細胞［21］（感染EB病毒后永生化的人淋巴細胞）和豬胚胎成纖維細胞均由華大基因研究院動物基因工程實驗室提供，質(zhì)粒pGH-ED-L2和pGH-N-LMP1均由上海捷瑞生物工程有限公司合成

1.2 工具酶與主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購于New England Biolabs，2*Taq Plus PCR Master Mixture、pMD?18-T Vector、第一鏈cDNA合成試劑盒均購自TaKaRa（大連）公司，基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購自TIANGEN（北京）公司，Lipofectamine 2000來自Invitrogen（美國）公司，胎牛血清、高糖DMEM、G418、谷氨酰胺和非必須氨基酸均購自Gibco（美國）公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.4 各元件PCR產(chǎn)物的獲得與克隆

1.4.1 ED-L2啟動子的獲得：以質(zhì)粒pGH-ED-L2為模板，表1中ED-L2-F和ED-L2-R為引物進行PCR擴增，擴增程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。將所獲得的ED-L2片段與pMD18-T Simple載體連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建ED-L2的克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后由華大基因測序。

1.4.2 N-LMP1基因的獲得：以質(zhì)粒pGH-N-LMP1為模板，表1中N-LMP1-F和N-LMP1-R為引物進行PCR擴增，擴增程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。將所獲得的N-LMP1片段與pMD18-T Simple載體連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建N-LMP1的克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后由華大基因測序。

1.4.3 CR2基因的獲得：培養(yǎng)炎黃細胞后提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，按照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書操作。以第一鏈cDNA為模板，表1中CR2-F和CR2-R為引物進行PCR擴增，擴增程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。將所獲得的CR2片段與pMD18-T Simple載體連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建CR2的克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后由華大基因測序。

1.5 N-LMP1和CR2上皮組織特異表達載體的構(gòu)建

用SmaⅠ和Age I雙酶切CR2基因回收產(chǎn)物，與同樣酶切處理的pN1載體進行連接，構(gòu)建pN1-CR2重組質(zhì)粒；用Bgl II和Sal I雙酶切N-LMP1基因回收產(chǎn)物，與同樣酶切處理的pN1-CR2載體進行連接，構(gòu)建pN1-N-LMP1-CR2重組質(zhì)粒；用Ase I和Bgl II雙酶切ED-L2啟動子回收產(chǎn)物，與同樣酶切處理的pN1-N-LMP1-CR2載體進行連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，卡那青霉素篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆后提取質(zhì)粒，獲得表達載體pN1-ED-L2-NLMP1-CR2，對重組質(zhì)粒進行酶切和DNA測序鑒定。

1.6 轉(zhuǎn)染

將豬胚胎成纖維細胞接種于12孔板培養(yǎng)皿中，待細胞生長至85％～90％融合度時棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次。在微量離心管中準備溶液A、B。A液：1μg質(zhì)粒+50μL無血清培養(yǎng)基；B液：5μL Lipofectamine 2000+50μL無血清培養(yǎng)基。A、B兩液室溫孵育5min后溫和混合，室溫放置20min，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，再用15％胎牛血清-DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至1mL，將培養(yǎng)皿放入38℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，整個過程不加雙抗。

1.7 陽性克隆的篩選與鑒定

轉(zhuǎn)染72h后，在含有G418（500mg/mL）的選擇培養(yǎng)基中加壓篩選8d，獲得具有抗生素抗性的陽性細胞克隆，擴增培養(yǎng)。取少量細胞提取基因組DNA進行PCR鑒定，將鑒定陽性的細胞擴大培養(yǎng)凍存，留作核移植供體細胞。

2 結(jié)果

2.1ED-L2、N-LMP1和CR2的擴增

圖1 ED-L2、N-LMP1和CR2的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of ED-L2，N-LMP1 and CR2

通過PCR擴增，獲得794bp的ED-L2序列和1 290bp的N-LMP1序列（圖1），獲得的DNA片段，大小與預期結(jié)果一致，經(jīng)測序鑒定正確。通過RT-PCR擴增，獲得3 115bp的CR2片段（圖1），經(jīng)測序鑒定與GenBank中序列進行Blast比對，結(jié)果一致。

圖2 重組質(zhì)粒pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmid pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2

2.2 上皮組織特異性表達N-LMP1和CR2的表達載體pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的構(gòu)建與鑒定

2.2.1 pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的構(gòu)建：構(gòu)建的載體以ED-L2為啟動子，N1自帶的SV40polyA為終止信號，Neomycin是G418篩選標記。見圖2。

2.2.2 pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2載體的酶切鑒定結(jié)果：重組質(zhì)粒pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2經(jīng)Ase I和Sal I雙酶切后理論上可切出7 218bp的片段和2 071bp的片段，經(jīng)Ase I單酶切為9.3kb的片段，電泳圖片符合理論要求，且測序與預期序列完全一致，載體構(gòu)建成功。見圖3。

2.3 陽性克隆的鑒定

在含有G418的選擇培養(yǎng)基中篩選8d，獲得具有抗生素抗性的陽性細胞克隆，提取細胞基因組DNA為模板擴增出N-LMP1基因（1 290bp）和CR2基因（3 115bp）片段，說明所得到的陽性細胞的基因組已經(jīng)插入了目的片段。見圖4。

圖3 重組質(zhì)粒pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2 by enzyme digestion

3 討論

LMP1基因是EB病毒最可能的瘤基因，在EB病毒與鼻咽癌的關(guān)系這一研究領(lǐng)域中，LMP1的研究是一大熱點。LMP1是一跨膜蛋白，標準株EBV來源的LMP1（B-LMP1）含有386個氨基酸，它由一個短的N端胞內(nèi)區(qū)，跨膜區(qū)及一個長的C端胞內(nèi)區(qū)組成。NPC來源的LMP1基因（N-LMP1）由Hu等克隆，來自中國鼻咽癌患者，它的DNA序列與標準株LMP1存在明顯差異，最明顯的差異在于它的第三外顯子有一個30bp堿基的缺失和3個33bp重復序列的插入，從而導致它編碼404個氨基酸［8］。研究表明，N-LMP1在生物學功能上與標準株LMP1至少存在如下不同點［3，9，10，22，24］：1、N-LMP1比BLMP1致瘤性強；2、N-LMP1活化NFkB的能力比BLMP1強；3、N-LMP1的免疫原性比B-LMP1低；4、N-LMP1比B-LMP1能更大程度上調(diào)EGFR的表達。CR2是一個分子量為145kD的單鏈糖蛋白，N端在細胞外，含20個氨基酸的疏水信號膚及1005個氨基酸的膜外區(qū)，接著是24個氨基酸的疏水跨膜區(qū)，C端由34個氨基酸構(gòu)成胞漿尾，屬單一跨膜蛋白受體。CR2原為補體C3d的配體，后來的研究發(fā)現(xiàn)，EBV主要殼膜糖蛋白gp350/220分子中含有與C3d分子受體結(jié)合區(qū)核心序列EDPGKQLYNVEA高度同源的序列EDPGFENVEI，因而EBV同樣可與CR2分子結(jié)合［25］。為了能在鼻咽部上皮組織細胞里同時表達N-LMP1和CR2這兩種蛋白，本實驗運用了上皮特異性啟動子ED-L2，構(gòu)建了載體pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2，N-LMP1和CR2之間含有環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，導致兩個目的基因翻譯后不會形成融合蛋白。本研究所構(gòu)建的載體經(jīng)酶切與測序鑒定正確，將載體轉(zhuǎn)入豬胚胎成纖維細胞，所獲得克隆細胞經(jīng)PCR鑒定目的基因N-LMP1和CR2，獲得整合了兩個目的基因的胚胎成纖維細胞，為以后利用核移植技術(shù)生產(chǎn)鼻咽部上皮表達N-LMP1和CR2轉(zhuǎn)基因豬提供了供體細胞，為今后構(gòu)建與EBV感染相關(guān)的豬鼻咽癌模型奠定了基礎(chǔ)。

圖4 陽性克隆的鑒定A：PCR products of the N-LMP1 gene；M：DNA marker（1kp）；Lane 1：Positive control；Lane 2-3：Clone cells；Lane 4：Negative control；B：PCR products of the CR2 gene；M：DNA marker（1kp）；Lane 1：Positive control；Lane 2-3：Clone cells；Lane 4：Negative control.Fig.4 Identification of the positive clone cells

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Construction and identification of transgenic porcine embryonic fibroblasts expressing epithelium-specific N-LMP1 and CR2

HUANG Hai-cheng，LIU Huan，AN Jing
（Cancer Institute，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

ObjectiveTo construct an eukaryotic expression vector and identify the integration of nasopharyngeal carcinoma-derived oncogene latent membrane protein 1（N-LMP1）and CR2 gene in porcine embryonic fibroblasts，and to provide a basis for construction of EBV-infection associated swine nasopharyngeal carcinoma model.MethodsED-L2 and N-LMP1 were synthesized directly.CR2 was amplified by RT-PCR from human B lymphocytes.The three fragments mentioned above were subcloned one by one into the eukaryotic expression vector pN1，and then the vector was transfected into porcine embryonic fibroblasts using the liposome reagent，according to the manufacturer's protocol.The cells were selected with G418 antibiotic and identified by PCR amplification.ResultsN-LMP1 and CR2 epithelium-specific expression vector was successfully constructed and integrated into the genome of the porcine fibroblasts，and clone cells integrating the N-LMP1 and the CR2 genes were obtained.ConclusionsThe porcine fibroblast clones integrating N-LMP1 and CR2 are obtained and they should be of great value for the construction of N-LMP1 and CR2 transgenic swine via cellnuclear transfer.

N-LMP1；CR2；Porcine embryonic fibroblasts；Nasopharyngeal carcinoma

R33

A

1671-7856（2014）02-0001-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.001

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（K1010524）。

黃海城（1989-），男，碩士研究生，主要從事腫瘤基礎(chǔ)研究，E-mail：haicheng891@qq.com。

安靚（1959-），女，教授，主要從事干細胞與腫瘤干細胞的分化研究及轉(zhuǎn)基因動物的研究，E-mail：anjing77@163.com。

2013-11-19