高效液相色譜法測定糖化酶中葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的活性

李雙花， 馮 思， 陳茵佳， 李 彤，2*

(1.大連依利特分析儀器有限公司，遼寧大連116023;2.遼寧大連依利特分析儀器工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023)

在發(fā)酵法生產(chǎn)的糖化酶中常常含有葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(簡稱轉(zhuǎn)苷酶)，而在糖化酶催化麥芽糖和淀粉生產(chǎn)葡萄糖的過程中，它可打開麥芽糖的α-1，4鍵，并將游離出的一個葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個葡萄糖或麥芽糖的α-1，6鍵上，生成潘糖或異麥芽糖等低聚糖，從而大大影響葡萄糖產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量，同時異麥芽糖的存在也會阻礙葡萄糖結(jié)晶［1，2］。所以控制糖化酶中轉(zhuǎn)苷酶的活性，將有助于控制葡萄糖產(chǎn)品的質(zhì)量。

目前轉(zhuǎn)苷酶活性的測定方法有酶法［3，4］、分光光度法［5］、滴定法［6，7］等，但未見有高效液相色譜法測定的報道。酶法測定往往會出現(xiàn)不專一的情況，且易受到干擾;分光光度法則需要衍生，操作繁瑣;滴定法是通過顯色反應(yīng)來測定的，而肉眼觀察顏色變化的誤差較大。高效液相色譜法測定具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定的優(yōu)點，且易于實現(xiàn)自動化［8］，常被應(yīng)用于糖類樣品的分析［9，10］。本文以麥芽糖為底物，阿卡波糖為糖化酶抑制劑，采用SUGAR SH1011色譜柱、示差折光檢測器的高效液相色譜法對糖化酶中轉(zhuǎn)苷酶的活性進(jìn)行測定，獲得了較好的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

P230高壓恒流泵、EC2000色譜數(shù)據(jù)工作站(大連依利特分析儀器有限公司)。

葡萄糖(分析純，純度99.9%)、潘糖(分析純，純度99.9%)、麥芽糖(分析純，純度99.5%)、冰乙酸(分析純，純度99.5%)、濃硫酸(分析純)(天津科密歐);阿卡波糖(拜耳醫(yī)藥保健有限公司);糖化酶樣品1、2、3(湖南長沙某公司);去離子水(自制，Milli-Q超純水純化系統(tǒng)過濾)。

1.2 色譜條件

色譜柱為SUGAR SH1011色譜柱(300 mm×8.0 mm，6 μm;日本 Shodex公司)，流動相為0.01 mol/L硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為60℃，檢測器為RI-201H示差折光檢測器(日本Shodex公司)。

1.3 活性測定

樣品處理方法:移取0.4 mL 0.75 g/L阿卡波糖緩沖液(用20 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.8)溶解)和0.1 mL糖化酶稀釋液(將糖化酶原液用去離子水稀釋20倍)置于10 mL具塞試管中，渦旋混勻;將試管放于37℃水浴中平衡10 min，吸取0.5 mL 20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))麥芽糖溶液(用20 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.8)溶解)置于試管中，渦旋混勻，然后將試管放入37℃水浴中，培養(yǎng)20 h后取出，在開水中煮沸10 min滅酶，冷卻至室溫;加入9 mL流動相，充分混勻，過0.45 μm濾膜。

空白處理方法:移取0.4 mL前述0.75 g/L阿卡波糖緩沖液和0.1 mL糖化酶稀釋液置于10 mL具塞試管中，渦旋混勻;將試管放于37℃水浴中平衡10 min，渦旋混勻，然后將試管放入37℃水浴中，培養(yǎng)20 h后取出，在開水中煮沸10 min滅酶，冷卻至室溫;吸取0.5 mL 20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))麥芽糖溶液于試管中，混合均勻;加入9 mL流動相，充分混勻，過0.45 μm 濾膜。

潘糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液處理方法:稱取1.0 g(精確到0.001 g)潘糖于100 mL容量瓶中，加入流動相稀釋到刻度，配成質(zhì)量濃度為10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

由于產(chǎn)生的三糖較多，本方法中以潘糖為代表。通過液相色譜分析，得到樣品溶液和空白溶液中潘糖的峰面積之差，采用外標(biāo)法定量，求得潘糖的轉(zhuǎn)化量，從而間接測得轉(zhuǎn)苷酶的活性。

式中:M為轉(zhuǎn)苷酶活性(單位:U);A樣為樣品溶液中潘糖的峰面積(單位:mV·s);A空為空白溶液中潘糖的峰面積(單位:mV·s);A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液中潘糖的峰面積(單位:mAU·s);C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液中潘糖的質(zhì)量濃度(單位:g/L);V為樣液最終定容體積(單位:mL);T為培養(yǎng)時間(單位:min);F為糖化酶稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

高效液相色譜法測定糖類化合物含量具有快速、靈敏等優(yōu)點，故常用來測定糖類化合物。氨基柱常被用來測定糖類化合物，但采用氨基柱時流動相中含有乙腈，分析成本高，環(huán)境污染大，而且以乙腈/水體系為流動相容易出現(xiàn)示差檢測器基線波動大、平衡慢的問題，所以本實驗選擇SUGAR SH1011色譜柱，以硫酸水溶液為流動相測定潘糖含量。實驗結(jié)果表明當(dāng)硫酸濃度為0.01 mol/L時，葡萄糖、麥芽糖、潘糖和雜質(zhì)分離效果較好(見圖1)。

2.2 培養(yǎng)介質(zhì)、pH及培養(yǎng)時間的選擇

阿卡波糖在pH 4.8時抑制糖化酶的效果最佳，轉(zhuǎn)苷酶的轉(zhuǎn)苷最佳 pH為5.5［11］。綜合考慮選擇pH 4.8的醋酸緩沖液作為樣品及空白溶液的培養(yǎng)介質(zhì)。

轉(zhuǎn)苷酶在一定條件下將麥芽糖轉(zhuǎn)化為潘糖等三糖。從圖2中可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增長，酶解產(chǎn)生的潘糖逐漸增多，但是在20 h之內(nèi)的增長速度較快;在20 h之后，隨著麥芽糖濃度的下降和產(chǎn)生三糖濃度的增高，增長速度變緩慢?？紤]到時間關(guān)系，本文選擇培養(yǎng)時間為20 h。

圖1 (a)糖化酶樣品及(b)空白溶液的HPLC譜圖Fig.1 Chromatograms of(a)a diastatic enzyme sample and(b)a blank solution1.panose;2.maltose;3.glucose.

圖2 培養(yǎng)時間對潘糖轉(zhuǎn)化量的影響Fig.2 Effect of the incubation time on the transformation of panose

圖3 底物(麥芽糖)的濃度對潘糖轉(zhuǎn)化量的影響Fig.3 Effect of the concentration of substrate(maltose)on the transformation of panose

圖4 抑制劑(0.75 g/L阿卡波糖)用量對葡萄糖轉(zhuǎn)化量的影響Fig.4 Effect of usage of the inhibitor(0.75 g/L acarbose)on the transformation of glucose

2.3 底物(麥芽糖)濃度的選擇

由化學(xué)動力學(xué)原理可知，只要底物濃度足夠大，即可保證麥芽糖分解產(chǎn)生的三糖濃度只與酶濃度有關(guān)，而與麥芽糖濃度無關(guān)。但麥芽糖底物中常含有游離的三糖，隨著麥芽糖濃度的增大，游離三糖的量也隨之增大，導(dǎo)致空白值較高而影響測定結(jié)果。通過實驗發(fā)現(xiàn)麥芽糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時較為合適(見圖3)，此時底物濃度已足夠高，但空白溶液中游離三糖的濃度不是很高，不至于影響測定結(jié)果。

2.4 抑制劑(阿卡波糖)用量的選擇

實驗中阿卡波糖的作用是抑制糖化酶將麥芽糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。實驗結(jié)果表明，隨著阿卡波糖用量的增大，產(chǎn)生葡萄糖的量逐漸下降。本實驗使用阿卡波糖的質(zhì)量濃度為0.75 g/L，當(dāng)阿卡波糖的用量為0.4 mL時，產(chǎn)生葡萄糖的量基本趨于平衡(見圖4)，所以選擇阿卡波糖的用量為0.4 mL。

2.5 潘糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系及轉(zhuǎn)苷酶活性的檢出限、定量限

用流動相逐級稀釋10 g/L潘糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液得到一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行分析。實驗表明，在0.1～10 g/L范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度X(g/L)與峰面積 Y呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r為0.999 8，線性方程為Y=489.53X+7.61。分別按3倍信噪比(S/N=3)、10倍信噪比(S/N=10)確定轉(zhuǎn)苷酶活性檢出限為0.013 U、定量限為0.043 U。

2.6 方法的精密度

應(yīng)用建立的方法對2號糖化酶樣品重復(fù)6次測定。6次平行測定的RSD為0.63%，表明方法的重復(fù)性較好。

2.7 實際樣品的測定

將糖化酶樣品用去離子水稀釋20倍，按照1.3節(jié)的方法處理，在1.2節(jié)的色譜條件下進(jìn)行測定，得到糖化酶樣品1、2、3中轉(zhuǎn)苷酶的活性分別為3.91、3.91、1.03 U。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法測定糖化酶中轉(zhuǎn)苷酶的活性具有分析速度快、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點。實驗對底物濃度、培養(yǎng)時間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用建立的方法對不同批次糖化酶中轉(zhuǎn)苷酶的活性進(jìn)行了測定，取得了良好的結(jié)果，為糖化酶的研究和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

［1］ Zhang S M，Wang H J，Lü Y，et al.Journal of Henan Agricultural University(張世敏，王會娟，呂洋，等.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報)，2006，40(5):520

［2］ Wang L D.Grain Processing(王良東.糧食加工)，2008，33(6):65

［3］ QB 2521-2001

［4］ Zhang Q.［MS Dissertation］.Zhengzhou:Zhengzhou University(張茜.［碩士學(xué)位論文］.鄭州:鄭州大學(xué))，2011

［5］ Zhao K，Lou Z H.Light Industry Science and Technology(趙柯，樓志華.輕工科技)，2013(12):19

［6］ Chen Y P，Wang Y，Hu X Z.Journal of Wuxi University of Light Industry(陳燁璞，汪云，胡學(xué)錚.無錫輕工大學(xué)學(xué)報)，1998，17(3):86

［7］ Lin W X，Yun X，Liu Y X，et al.Journal of Dalian Institute and Light Industry(林維宣，云霞，劉英新，等.大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報)，1996，15(1):73

［8］ Fan H M，Yu S，Tang Y F.Journal of Food Safety and Quality(樊惠民，余實，譚遠(yuǎn)方.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報)，2011，2(3):174

［9］ Dai J.Chinese Journal of Chromatography(戴軍.色譜)，2012，30(2):113

［10］ Zou Y H，Ju H F，Chen A Y.Journal of Instrumental Analysis(鄒耀洪，居紅芳，陳愛英.分析測試學(xué)報)，2005，21(3):34

［11］ Bi J F，Huang Y.Science and Technology of Food Industry(畢金峰，黃穎.食品工業(yè)科技)，2004，25(2):119