分散液液微萃取－衍生化高效液相色譜－熒光檢測法測定環(huán)境水樣中4種酚類內(nèi)分泌干擾物

王曉燕， 亓偉梅， 趙先恩＊， 呂 濤， 王西亞，鄭龍芳， 閆業(yè)浩， 尤進(jìn)茂，3＊

（1.山東省生命有機(jī)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東 曲阜273165；2.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工教研室，山東 萊蕪271100；3.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧810001）

雙酚A（BPA）、辛基酚（OP）、壬基酚（NP）和對特辛基酚（POP）等酚類環(huán)境污染物是典型的內(nèi)分泌干擾物，極微量就能嚴(yán)重干擾人的內(nèi)分泌功能，對人類健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成巨大威脅。因此建立該類毒物快速靈敏的檢測方法在環(huán)境分析和食品分析領(lǐng)域具有重要意義［1－3］。

水中酚類化合物的提取方法常用液液萃取法（LLE）［4］和 固 相 萃 取 法 （SPE）［5，6］，但 存 在 萃 取 率低、有機(jī)溶劑消耗大、操作繁瑣等缺點(diǎn)。自2006年Assadi等［7］首次報(bào)道分散液液微萃?。╠ispersive liquid－liquid microextraction，DLLME）以來，因其所需萃取溶劑量少、萃取速度快、萃取效率和富集倍數(shù)高、操作簡便和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為一種極具潛力的分離富集技術(shù)［8］，DLLME已被應(yīng)用于多種酚類化合物的萃?。?，10］。

酚類內(nèi)分泌干擾物的檢測方法主要包括GC、GC－MS、HPLC、HPLC－MS、CE 等［4，5，11，12］。HPLC－直接紫外或熒光檢測的靈敏度差、基質(zhì)干擾嚴(yán)重，往往無法實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品的準(zhǔn)確檢測。GC和GC－MS法對樣品前處理?xiàng)l件要求苛刻，重復(fù)性不夠理想，且GC－MS、HPLC－MS儀器昂貴。CE具有樣品用量少、分離能力強(qiáng)和分離速度快等優(yōu)點(diǎn)，但其樣品前處理要求高，在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有限。柱前衍生化通過分子標(biāo)記技術(shù)，將衍生化試劑含有的色譜或質(zhì)譜增敏的功能基團(tuán)引入到檢測物中，能夠顯著提高分析物的靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確度等［13］，具有顯著優(yōu)勢。最近，DLLME技術(shù)結(jié)合柱前衍生的樣品前處理方法已開始在HPLC分析中得到應(yīng)用［14］，與傳統(tǒng)方法相比優(yōu)勢顯著。

本研究采用DLLME法對環(huán)境水樣中4種酚類污染物進(jìn)行快速萃取，結(jié)合柱前衍生技術(shù)［15］，建立了酚類毒物的高靈敏HPLC－FLD方法，具有水樣用量少、準(zhǔn)確、快速、方便的優(yōu)勢。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀，配備四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、熒光檢測器、自動進(jìn)樣器、恒溫柱溫箱（Agilent公司）；XW－80A漩渦混勻器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

BPA和POP購自百靈威科技有限公司，NP購自Alfa Aesar公司，OP購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純（Sigma公司）；碳酸鈉、碳酸氫鈉和其他試劑均為分析純（天津廣成化學(xué)試劑有限公司）；衍生化試劑2－［2－（7 H－二苯并［a，g］咔唑－乙氧基）］－乙基氯甲酸酯（DBCEC－Cl，純度99%）為本實(shí)驗(yàn)室合成［15］。水由 Millipore公司純水器制備。

1.2 溶液配制與環(huán)境水樣

分別稱取適量的烷基酚標(biāo)準(zhǔn)品并溶解于乙腈中，濃度為0.01 mol／L，相應(yīng)低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋而成。取等體積的4種酚類單標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0×10－4mol／L）配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（均為2.5×10－5mol／L）。稱取34.7 mg DBCEC－Cl用乙腈定容于10 mL容量瓶中，濃度為0.01 mol／L，相應(yīng)低濃度的衍生試劑用乙腈稀釋而成。

造紙廠廢水取自濟(jì)寧市某造紙廠，湖水取自曲阜師范大學(xué)圖書館前的湖中，生活廢水取自護(hù)城河排水口；水樣過0.45μm濾膜待用。自來水為城市自來水廠供應(yīng)。

1.3 樣品前處理方法

吸取5 mL環(huán)境水樣于尖底離心試管中，加入400μL乙腈作為分散劑，70μL氯仿作為萃取劑，室溫下漩渦振蕩萃取3 min，高速（12 000 r／min）離心2 min，精確吸取下層有機(jī)相50μL，氮吹至干，用乙腈復(fù)溶后待衍生化。

傳統(tǒng)的液液萃取方法參照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。

1.4 衍生化方法

安培瓶中加入200μL乙腈、適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（或環(huán)境水樣DLLME萃取物，氮吹至干復(fù)溶物）、180μL衍生試劑（1 mmol／L）和100μL碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖液（pH10.5），封口后渦旋混勻10 s，于50℃恒溫水浴中反應(yīng)3 min，加入10μL25%（v／v，下同）甲酸水溶液調(diào)節(jié)pH3～5，過0.45μm濾膜后進(jìn)樣10μL分析。衍生化反應(yīng)示意圖見圖1。

圖1 2－［2－（7 H－二苯并［a，g］咔唑－乙氧基）］－乙基氯甲酸酯（DBCEC－Cl）與酚類化合物的衍生化反應(yīng)Fig.1 Derivatization reaction between DBCEC－Cl and phenolic endocrine disruptors

1.5 HPLC條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm；大連依利特分析儀器有限公司）。流動相：A相為20%乙腈水溶液（含0.1%甲酸），B相為乙腈（含0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0～7 min，90%B線性變化到100%B；7～12 min，100%B。流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃。熒光激發(fā)波長（λex）和發(fā)射波長（λem）分別為300 nm和395 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生條件的優(yōu)化

DBCEC－Cl是典型的碳酰氯類衍生試劑，在適當(dāng)?shù)膲A性水／乙腈溶液中，對酚羥基的衍生速率較快。衍生溶液的pH對衍生反應(yīng)影響非常明顯，本文首先考察了該因素。對比pH7.0～11.0之間的碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖液，發(fā)現(xiàn)pH為7.0～8.5時(shí)衍生反應(yīng)幾乎不發(fā)生；當(dāng)pH大于9.0后，4種酚衍生物的峰面積隨pH增大而顯著增高，在pH10.5時(shí)達(dá)到最大值；再增大pH，其峰面積顯著下降。這歸因于接近pH11.0的強(qiáng)堿性導(dǎo)致了衍生試劑和衍生物的分解。因此選擇在pH10.5的碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖液中進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

同時(shí)考察了4種酚衍生產(chǎn)物的峰面積隨衍生試劑用量、緩沖液用量、衍生時(shí)間、溫度的變化規(guī)律。對衍生試劑用量的考察結(jié)果表明：隨衍生試劑用量的增大，衍生物的峰面積逐漸增大，當(dāng)衍生試劑用量為4種酚總的物質(zhì)的量的15倍時(shí)衍生物的峰面積最大；進(jìn)一步增加衍生試劑用量未見峰面積繼續(xù)增大，因此選用衍生試劑用量為15倍于分析物的物質(zhì)的量（圖2a）。對pH10.5的碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖溶液用量的考察結(jié)果表明：緩沖溶液超過100μL時(shí)，BPA的峰面積開始下降；緩沖溶液超過150μL時(shí)，POP、OP、NP的峰面積下降明顯，可能因?yàn)檠苌w系含堿性水溶液過多導(dǎo)致競爭性的衍生試劑水解反應(yīng)加快，因此實(shí)驗(yàn)選用100μL緩沖溶液（圖2b）。對衍生時(shí)間和溫度的考察結(jié)果表明：衍生時(shí)間3 min、溫度50℃時(shí)衍生物的峰面積最大；繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間和提高溫度（超過10 min，超過50℃），并未見衍生物的峰面積增加，反而會導(dǎo)致一定程度的降低（圖2c和2d），可能是由于時(shí)間過長、溫度過高導(dǎo)致衍生物分解，因此最終選用3 min、50℃作為最佳條件。

2.2 DLLME條件的優(yōu)化

本研究的目標(biāo)是通過DLLME和熒光衍生化的有效結(jié)合，實(shí)現(xiàn)室溫下小體積環(huán)境水樣中4種酚類污染物的快速、簡便、高效萃取，為環(huán)境分析工作提供有效途徑。由于在酸性條件下酚類化合物才完全以分子形式存在，有利于有機(jī)溶劑萃取，因此本研究用稀鹽酸將水樣pH調(diào)至4.0再進(jìn)行萃取。以HPLC－FLD測定的峰面積為參照，用同一份加標(biāo)水樣對比優(yōu)化DLLME參數(shù)。

在DLLME中，萃取劑和分散劑的種類及用量是影響萃取效率的重要因素。對4種萃取劑（二氯甲烷、氯仿、四氯化碳和辛醇）和4種分散劑（乙腈、甲醇、乙醇和丙酮）分別組合考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯仿與乙腈組合時(shí)，不但能夠形成穩(wěn)定的兩相，而且HPLC響應(yīng)值最高，干擾物少，且回收率穩(wěn)定。因此實(shí)驗(yàn)選定氯仿作為萃取劑，乙腈作為分散劑?？疾炝溯腿┖头稚┑挠昧?，發(fā)現(xiàn)萃取劑氯仿用量為70μL（圖3a）、分散劑乙腈用量為400μL（圖3b）時(shí)，萃取效率最高。為建立快速微萃取方法，在上述最佳條件下優(yōu)化了萃取時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在漩渦混勻器上劇烈振蕩3 min即可獲得最高的HPLC響應(yīng)值。

圖2 （a）衍生試劑用量、（b）Na2CO3－NaHCO3 緩沖液用量、（c）衍生時(shí)間、（d）衍生溫度對4種酚衍生物峰面積的影響Fig.2 Effects of（a）molar ratio of derivatization reagent，（b）volume of Na2CO3－NaHCO3buffer，（c）derivatization time，（d）derivatization temperature on the peak area of the four phenol derivativesBPA：bisphenol A；NP：nonylphenol；OP：octylphenol；POP：4－tert－octylphenol.Derivatization reagent：DBCEC－Cl（1 mmol／L）；buffer：0.1 mol／L Na2CO3－NaHCO3 （pH10.5）.Derivatization conditions were optimized using single factor experiments.

圖3 （a）萃取劑氯仿用量和（b）分散劑乙腈用量對4種酚衍生物峰面積的影響Fig.3 Effects of（a）volume of extraction solvent chloroform and（b）volume of dispersing solvent acetonitrile on the peak area of the four phenol derivatives

采用上述最優(yōu)化條件進(jìn)行一次DLLME后，完全吸取下層有機(jī)相，再對該水樣進(jìn)行一次DLLME提取并衍生化后進(jìn)行HPLC－FLD測定，未見4種酚被檢出。該結(jié)果表明所建立的DLLME條件對酚類污染物的萃取率高。

傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑液液萃取法［4］，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，應(yīng)用該方法進(jìn)行提取，3次測定的加標(biāo)回收率均低于70%。DLLME法與其相比，具有有機(jī)溶劑用量少、快速、簡便、萃取效率高等優(yōu)點(diǎn)。

2.3 方法評價(jià)

2.3.1 HPLC條件優(yōu)化

既要快速分離又要使4種酚衍生物有足夠的分離度，以避免環(huán)境水樣的基質(zhì)干擾。通過對比不同色譜柱（Hypersil BDS和ODS不同品牌和規(guī)格的色譜柱）、調(diào)整梯度洗脫程序及流動相的pH值，最終確定了1.5節(jié)所述的分離條件。在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了4種酚類衍生物的基線分離，HPLC－FLD譜圖見圖4。由于DBCEC熒光發(fā)色基團(tuán)中含有一個(gè)弱堿性的氮原子，用0.1%甲酸控制流動相的pH值能夠?qū)崿F(xiàn)快速洗脫，并且改善分離度和峰形。

采用Agilent 1100 HPLC－FLD儀器的在線熒光光譜掃描功能，結(jié)合熒光分光光度計(jì)掃描，確定4種酚衍生物HPLC檢測的最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為300 nm和395 nm。

2.3.2 線性回歸方程、檢出限和定量限

在空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照DLLME和衍生化方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣量在20.9 pmol～16.3 fmol范圍內(nèi)，依據(jù)峰面積Y和實(shí)際進(jìn)樣量X 進(jìn)行線性回歸，所得各酚衍生物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（S／N＝3）和定量限（S／N＝10）見表1，可見線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.997，檢出限在0.9～1.6 ng／L 之間，定量限在3.8～7.1 ng／L 之間。

圖4 4種酚衍生物的HPLC－FLD譜圖Fig.4 Chromatogram of the four standard phenol derivatives with DBCEC－Cl by HPLC－FLDHPLC－FLD conditions：Hypersil BDS C18 column（200 mm×4.6 mm，5μm）；flow rate，1.0 mL／min；injection volume，10 μL；column temperature，30℃；fluorescence detection，λex／λem＝300 nm／395 nm.DBCEC－OH and（DBCEC）2were the main decomposition products of derivatization reagent DBCEC－Cl.

表1 4種酚衍生物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限與精密度（n＝6）Table 1 Linear regression equations，correlation coefficients（R），LODs，LOQs and precisions ofthe four phenol derivatives（n＝6）

2.3.3 穩(wěn)定性和精密度

取新制備的一份加標(biāo)環(huán)境水樣衍生液，分別在室溫下放置0、1、2、4、8、12、24和72 h后進(jìn)行色譜分析，各時(shí)間點(diǎn)4種酚衍生物峰面積的RSD均小于4.0%，表 明4 種 酚 的 DBCEC－Cl衍 生 物 穩(wěn) 定性良好。

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，取新制備的一份加標(biāo)環(huán)境水樣衍生液，平行6次進(jìn)樣分析，保留時(shí)間和峰面積的精密度見表1，結(jié)果表明方法的精密度良好。

2.3.4 與文獻(xiàn)方法的比較

對比了本研究方法與以往相關(guān)研究在檢出限、水樣體積、分離時(shí)間、檢測方法、衍生化（或直接檢測）等方面的優(yōu)缺點(diǎn)（見表2）。在檢出限方面，本方法的檢出限僅為不經(jīng)衍生化的直接HPLC－UV或HPLC－FLD 的檢出限的幾百之一或千分之一［10，16］；與經(jīng)SPE或DLLME的HPLC－FLD的檢出限相當(dāng)或?yàn)槠鋷追种唬瑫r(shí)考慮到方法檢出限所對應(yīng)的水樣體積［6，9，17］，本方法具有明顯的優(yōu)勢；與 GCMS的檢出限相當(dāng)或?yàn)槠鋷资种唬?，18］。因此本方法具有一定的優(yōu)勢和顯著的實(shí)用性。這一方面得益于DLLME技術(shù)，另一方面與本方法所采用的衍生化試劑結(jié)構(gòu)相關(guān)。DBCEC－Cl具有雙苯并咔唑結(jié)構(gòu)，分子共軛體系大，摩爾吸光系數(shù)ε＝5.30×104L／（mol·cm）［15］。另外，DBCEC－Cl衍生化方法條件溫和、快速，HPLC分離時(shí)間短，熒光檢測靈敏度高，檢測器便宜，容易普及?？傊珼LLME技術(shù)與DBCEC－Cl衍生化方法的有益結(jié)合，為本方法帶來了多方面的優(yōu)勢。

表2 本研究方法與文獻(xiàn)方法的比較Table 2 Comparison of this method with the reported methods

2.4 環(huán)境水樣分析及回收率測定

采用上述最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，對4種環(huán)境水樣中4種酚類化合物進(jìn)行了含量和加標(biāo)回收率測定，加標(biāo)量為4種酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL（各酚濃度為2.5×10－6mol／L），平行測定3次，取平均值。檢測結(jié)果（見表3）顯示，工業(yè)廢水、生活廢水中含有一定量的酚類內(nèi)分泌干擾物。其中加標(biāo)的生活廢水樣品的色譜圖見圖5。

表3 4種環(huán)境水樣中酚類化合物的含量及加標(biāo)回收率（n＝3）Table 3 Contents and spiked recoveries of the phenols in four environmental water samples（n＝3）

圖5 加標(biāo)的生活廢水中4種酚衍生物的色譜圖Fig.5 Chromatogram of the four phenol derivatives spiked in domestic wastewater sampleChromatographic conditions are the same as in Fig.4.

3 結(jié)論

利用DLLME技術(shù)與高靈敏熒光衍生化相結(jié)合的策略，建立了4種酚類污染物的HPLC－FLD測定方法。該方法具有操作簡便、高靈敏、快速、準(zhǔn)確、環(huán)境友好等特點(diǎn)，且具有一定的實(shí)用性。檢測結(jié)果顯示，工業(yè)廢水、生活廢水中含有一定量的酚類內(nèi)分泌干擾物，需進(jìn)行水處理和監(jiān)控，以減少對生態(tài)系統(tǒng)和飲用水的污染。

［1］ Asimakopoulos A G，Thomaidis N S，Koupparis M A.Toxicol Lett，2012，210（2）：141

［2］ Wang J C，Xiong L，Zhang H J，et al.Chinese Journal of Chromatography（王金成，熊力，張海軍，等.色譜），2011，29（12）：1160

［3］ Xiao J，Shao B，Wu X Y，et al.Biomed Environ Sci，2011，24（1）：40

［4］ Sun X W，Zhang Y B，Lin H，et al.Chinese Journal of Analytical Science（孫秀武，張?jiān)獦?biāo)，林輝，等.分析科學(xué)學(xué)報(bào)），2013，29（2）：149

［5］ Liao T，Wu X C，Wang S H，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（廖濤，吳曉翠，王少華，等.分析化學(xué)），2013，41（3）：422

［6］ Zhang S J，You J M，Sun Z W，et al.Microchem J，2012，103：90

［7］ Rezaee M，Assadi Y，Hosseini M M，et al.J Chromatogr A，2006，1116：1

［8］ Ma Y L，Chen L X，Ding Y J，et al.Chinese Journal of Chromatography（馬燕玲，陳令新，丁養(yǎng)軍，等.色譜），2013，31（2）：155

［9］ Li Y，Liu J L，Jian Y H.Chinese Journal of Analytical Chemistry（李魚，劉建林，翦英紅.分析化學(xué)），2009，37（10）：1484

［10］ López－Darias J， Germán－Hernández M，Pino V，et al.Talanta，2010，80（5）：1611

［11］ Huang S C，Hang Y P.Chinese Journal of Chromatography（黃少嬋，杭義萍.色譜），2010，28（9）：863

［12］ Dong Y L，Chen X J，Hu J，et al.Chinese Journal of Chromatography（董亞蕾，陳曉姣，胡敬，等.色譜），2012，30（11）：1117

［13］ Escrig－Doménech A，Simó－Alfonso E F，Herrero－Martínez J M，et al.J Chromatogr A，2013，1296：140

［14］ Nuhu A A，Basheer C，Saad B.J Chromatogr B，2011，879：1180

［15］ Yan T，Sun X J，Zhao H X，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（閆濤，孫學(xué)軍，趙懷鑫，等.分析化學(xué)），2009，37（6）：788

［16］ Wang X D，Zhao X H，Zhang X B.Chinese Journal of Analysis Laboratory（王曉東，趙新華，張新波，等.分析試驗(yàn)室），2006，25（9）：27

［17］ Li Y，Liu J L，Zhang C.Chinese Journal of Analytical Chemistry（李魚，劉建林，張琛，等.分析化學(xué)），2012，40（1）：107

［18］ Gatidou G，Thomaidis N S，Stasinakis A S，et al.J Chromatogr A，2007，1138：32