高效液相色譜手性流動(dòng)相添加法拆分阿卓乳酸對(duì)映體

張 虎， 沈芒芒， 童勝?gòu)?qiáng)， 顏繼忠

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310032）

阿卓乳酸（atrolactic acid），又名α－甲基扁桃酸，是一種重要的非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥合成中間體（其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），可用來(lái)合成多種2－芳基丙酸類(lèi)藥物中間體［1，2］，其活性成分主要存在于S型異構(gòu)體中，而R型異構(gòu)體活性甚微，甚至沒(méi)有活性［3］。

關(guān)于阿卓乳酸對(duì)映體在手性色譜柱上的拆分或用毛細(xì)管電泳技術(shù)拆分的報(bào)道較多［4－9］。高效液相色譜（HPLC）技術(shù)有著良好的方法重復(fù)性，且可在制備型高效液相色譜上放大，但手性色譜柱價(jià)格普遍較高，適用性不廣。而手性流動(dòng)相添加法使用常規(guī)色譜柱，選擇范圍寬，在手性藥物的拆分中被廣泛應(yīng)用。在阿卓乳酸對(duì)映體的拆分中有兩篇報(bào)道［10，11］，其分別以銅離子與 L－氨基酸衍生物的配合物為手性添加劑或以白蛋白為配合劑與修飾后的色譜柱一起使用完成阿卓乳酸對(duì)映體的拆分，這兩種手性流動(dòng)相拆分方法的過(guò)程均需較為復(fù)雜的衍生化，且由于受到添加劑的影響使對(duì)映體的檢測(cè)比較困難。環(huán)糊精及其衍生物作為高效液相色譜手性流動(dòng)相添加劑，價(jià)廉易得，無(wú)需衍生化且一般不影響對(duì)映體的紫外檢測(cè)，在手性化合物拆分中的應(yīng)用日漸廣泛［12－15］。

磺丁基醚－β－環(huán)糊精（SBE－β－CD）是陰離子型高水溶性環(huán)糊精衍生物，能通過(guò)范德華力、疏水作用、氫鍵等很好地與藥物分子包合形成非共價(jià)復(fù)合物。本文以SBE－β－CD作為手性流動(dòng)相添加劑，以C18柱為分離柱，采用HPLC拆分阿卓乳酸。考察了不同環(huán)糊精衍生物類(lèi)型、SBE－β－CD的濃度、流動(dòng)相pH和流速、柱溫等因素對(duì)手性分離的影響，同時(shí)探討了SBE－β－CD和阿卓乳酸對(duì)映體在HPLC中的包結(jié)機(jī)制。

圖1 阿卓乳酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of atrolactic acid

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

島津SCL－10AVP液相色譜儀，包括SPD10Avp紫外檢測(cè)器、LC－10ATvp液相泵、AT－330柱溫箱、CLASS－VP色譜工作站；Mettler－Toledo酸度計(jì)。

外消旋阿卓乳酸半水物購(gòu)于東京化成工業(yè)株式會(huì)社（日本東京），含量大于97.0%；羥丙基－β－環(huán)糊精（HP－β－CD）、甲 基－β－環(huán) 糊 精 （Me－β－CD）、SBE－β－CD購(gòu)于山東千匯精細(xì)化工有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；水為二次蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：YMC－Pack ODS－A C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：含25 mmol／L SBE－β－CD 的0.1 mol／L 磷酸鹽緩沖液（pH2.68，0.1 mol／L磷酸二氫鈉溶液中滴加0.1 mol／L 磷酸溶液調(diào)節(jié)）－乙腈（90∶10，v／v）；流速：0.6 mL／min；柱溫：30℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

精密稱(chēng)取10.0 mg的阿卓乳酸對(duì)映體于25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解、稀釋至刻度，制成0.4 g／L標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱中冷藏保存。臨用前取適量上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即可在色譜條件下進(jìn)行阿卓乳酸對(duì)映體的拆分。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同β－環(huán)糊精衍生物對(duì)手性分離的影響

實(shí)驗(yàn)中考察了 HP－β－CD、Me－β－CD 和 SBE－β－CD對(duì)阿卓乳酸對(duì)映體手性分離的影響，其他色譜條件不變。在水相（pH2.68，含20 mmol／L HP－β－CD）－乙腈（90∶10，v／v）條件下阿卓乳酸對(duì)映體沒(méi)有任何分離跡象；減小乙腈的體積比，在水相－乙腈（98∶2，v／v）時(shí)或 增大手性 添加劑濃 度 至 25 mmol／L時(shí)，阿卓乳酸對(duì)映體也只有微弱的分離；將流動(dòng)相有機(jī)修飾劑改為甲醇，在相同色譜條件下阿卓乳酸對(duì)映體無(wú)分離跡象且洗脫時(shí)間延長(zhǎng)；將手性添加劑改為Me－β－CD，阿卓乳酸對(duì)映體同樣無(wú)分離跡象；SBE－β－CD 作 為手 性添 加劑，在水相 （pH 2.68，含20 mmol／L SBE－β－CD）－乙腈（95∶5，v／v）條件下可拆分阿卓乳酸對(duì)映體，但洗脫時(shí)間較長(zhǎng)；增大有機(jī)修飾劑比例至水相－乙腈（90∶10，v／v），可拆分阿卓乳酸對(duì)映體且大大縮短了洗脫時(shí)間。可以看出，用 HP－β－CD 和 Me－β－CD 作為手性添加劑無(wú)法拆分阿卓乳酸對(duì)映體，只有SBE－β－CD可拆分對(duì)映體。這可能是因?yàn)榘⒆咳樗釋?duì)映體分子的結(jié)構(gòu)、大小與SBE－β－CD的空腔更為匹配。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇SBE－β－CD作為手性流動(dòng)相添加劑。

2.2 手性添加劑濃度對(duì)手性分離的影響

SBE－β－CD的濃度對(duì)對(duì)映體分離的影響見(jiàn)表1。隨著手性添加劑SBE－β－CD濃度在5～30 mmol／L范圍內(nèi)增大，阿卓乳酸對(duì)映體分離度逐漸增大。手性添加劑濃度的增大會(huì)增強(qiáng)其與對(duì)映體之間的相互作用，使阿卓乳酸對(duì)映體與SBE－β－CD生成的非對(duì)映體復(fù)合物之間的色譜行為差異擴(kuò)大，因此增大了分離度。實(shí)驗(yàn)表明，在一定的SBE－β－CD濃度范圍內(nèi)，增大手性添加劑濃度，對(duì)映體的保留時(shí)間會(huì)縮短，但隨流動(dòng)相黏度的增大色譜柱壓也會(huì)提高。綜合考慮保留時(shí)間和分離度，選擇SBE－β－CD的濃度為25 mmol／L。

表1 流動(dòng)相中SBE－β－CD的濃度對(duì)阿卓乳酸保留因子k和分離度Rs的影響Table 1 Effect of the concentration of SBE－β－CD in mobile phase on the retention factor（k）and resolution（Rs）of atrolactic acids

Armstrong等［16］的研究表明，環(huán)糊精類(lèi)衍生物與溶質(zhì)間大多存在1∶1（少數(shù)情況2∶1）的包結(jié)關(guān)系。如SBE－β－CD與對(duì)映體間存在1∶1的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，則對(duì)映體保留因子與SBE－β－CD濃度間應(yīng)符合如下關(guān)系式：

其中k為對(duì)映體的保留因子；Φ為相比；［A］為液相色譜柱固定相的吸附點(diǎn)濃度；［CD］為SBE－β－CD的濃度；K為對(duì)映體與色譜柱固定相吸附點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)；K1為對(duì)映體與環(huán)糊精形成1∶1包合物的包結(jié)常數(shù)。

將1／k 對(duì)SBE－β－CD的濃度［CD］作圖，若為直線即符合公式（1），說(shuō)明阿卓乳酸與SBE－β－CD形成1∶1的包合物。根據(jù)表1的數(shù)據(jù)分別以兩對(duì)映體的1／k對(duì)SBE－β－CD的濃度作圖（見(jiàn)圖2）。得線性回歸 方 程 依 次 為 1／k＋＝0.005 1［CD］＋0.121 7（R2＝0.999 7），1／k－ ＝0.004 3［CD］＋0.122 7（R2＝0.999 4），兩條曲線都呈良好的線性關(guān)系，說(shuō)明阿卓乳酸與SBE－β－CD形成了1∶1的包合物，且通過(guò)直線的截距和斜率得出了兩個(gè)對(duì)映體與SBE－β－CD形成包合物過(guò)程中的包結(jié)常數(shù)分別為41.9和35.0 L／mol。

圖2 1／k與手性添加劑SBE－β－CD濃度的關(guān)系Fig.2 1／k plotted against the SBE－β－CD concentration

2.3 流動(dòng)相pH對(duì)手性分離的影響

流動(dòng)相pH對(duì)手性化合物，特別是自身帶有酸堿基團(tuán)的化合物的分離有重大影響。如表2所示，在其他色譜條件不變的情況下，在pH2.5～4.0之間隨著pH的增大，阿卓乳酸的保留時(shí)間不斷減小，分離度也逐漸減小，pH2.5～3.0時(shí)可以達(dá)到完全分離。其原因可能是阿卓乳酸本身就是一種有機(jī)酸，含有可電離的羥基和羧酸基團(tuán)，pH增大使其電離程度加大，與流動(dòng)相中帶負(fù)電的SBE－β－CD之間的靜電作用力減弱，手性識(shí)別能力隨之減弱，且其分子極性增加，在反相色譜柱上難以保留，洗脫時(shí)間也大大縮短?？紤]到保留時(shí)間與分離度，選用pH2.68。

表2 流動(dòng)相pH對(duì)阿卓乳酸分離度的影響Table 2 Effect of pH value of mobile phase on the resolution of atrolactic acids

2.4 柱溫對(duì)手性分離的影響

考察了柱溫（25～40℃）對(duì)阿卓乳酸對(duì)映體分離的影響。如表3所示，隨著柱溫的升高，阿卓乳酸對(duì)映體的分離度逐漸減小，保留時(shí)間略有縮短。原因可能是溫度的升高使阿卓乳酸對(duì)映體與SBE－β－CD生成的非對(duì)映體復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，其色譜行為差異隨之減小。考慮到保留時(shí)間與分離度，確定最佳柱溫為30℃。

表3 柱溫對(duì)阿卓乳酸分離度的影響Table 3 Effect of column temperature on theresolution of atrolactic acids

2.5 流速對(duì)手性分離的影響

在阿卓乳酸對(duì)映體的分離中，流速?gòu)?.40 mL／min逐漸增大到0.80 mL／min 時(shí)，阿卓乳酸對(duì)映體的保留時(shí)間逐漸縮短，峰寬變窄，但柱壓不斷增大，如表4所示。本文最終選取0.6 mL／min作為流動(dòng)相的最佳流速。

表4 流動(dòng)相流速對(duì)阿卓乳酸分離度的影響Table 4 Effect of flow rate of mobile phase on the resolution of atrolactic acids

2.6 方法重復(fù)性

在優(yōu)化的色譜條件下分離阿卓乳酸對(duì)映體，結(jié)果見(jiàn)圖3。進(jìn)樣6次，對(duì)映體的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于1.5%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

圖3 HPLC拆分阿卓乳酸對(duì)映體的色譜圖Fig.3 Chromatogram for enantioseparation of atrolactic acids by HPLC

3 結(jié)論

以SBE－β－CD為高效液相色譜流動(dòng)相手性添加劑，拆分了阿卓乳酸對(duì)映體。本方法分離度好，靈敏度高，簡(jiǎn)便易行，且比手性固定相的方法更經(jīng)濟(jì)，易普及，為阿卓乳酸對(duì)映體的進(jìn)一步深入研究提供了一種新方法。

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