南瓜汁發(fā)酵優(yōu)良乳酸菌的篩選與鑒定

李慧，趙婧，陳超，李全宏

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083）

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細菌統(tǒng)稱，是益生菌的主要來源，廣泛分布在自然界中[1]。乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高食物消化率和生物價、降低血清膽固醇、減緩乳糖不耐癥等多種生理功能[2]。南瓜是一種廣泛種植的蔬菜，含有多種生理活性物質(zhì)，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、清除自由基、抗過敏等功能[3-6]。目前，南瓜的加工處于初級階段，以提高南瓜附加值的精深加工顯得尤為重要。將乳酸菌與南瓜相結(jié)合開發(fā)乳酸菌發(fā)酵南瓜汁具有口感與風味獨特、營養(yǎng)價值高的特點，具有廣闊的前景。但是，研究表明，只有攝入106CFU/mL或以上的活性乳酸菌才能充分發(fā)揮其益生作用[7]。大部分乳酸菌在進入腸道之前，多因不能耐受高酸性胃液和高濃度膽鹽而死亡，從而影響了保健功能的發(fā)揮。因此，獲得耐受性高的菌株，使之順利通過胃進入腸道，對開發(fā)功能性乳酸菌發(fā)酵飲品具有重要意義。本實驗以不同市售酸奶及泡菜濃漿為原料，通過MRS培養(yǎng)基進行菌種分離純化，并對分離的菌株進行耐受性研究及發(fā)酵試驗，最終確定適合南瓜汁發(fā)酵的優(yōu)良菌株，為開發(fā)營養(yǎng)價值較高的發(fā)酵南瓜汁奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

市售酸奶、泡菜：購于北京美廉美超市；新鮮南瓜：購于中國農(nóng)業(yè)大學家屬區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，葡萄糖 20 g，吐溫 80 1 mL，磷酸氫二鉀 2 g，乙酸鈉 5 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，酵母粉4 g，溶解后用蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH至6.2～6.4，115℃滅菌25 min；含碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基：添加1%碳酸鈣，1.8%瓊脂的MRS培養(yǎng)基；斜面保存培養(yǎng)基：添加1.8%瓊脂的MRS培養(yǎng)基；其他生化試驗所用培養(yǎng)基配制參考文獻[8]。

1.3 儀器與設(shè)備

LX－B35L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；DHP－9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實驗儀器有限公司；FA1104電子天平：上海越平科學儀器有限公司；UV－2802紫外可見分光光度計：尤尼科（上海）儀器有限公司；九陽料理機：九陽股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的分離純化

各取不同品牌酸奶及泡菜濃漿1 mL，用0.75%的生理鹽水進行 10 倍梯度稀釋，取 10－4、10－5、10－6三個梯度的菌懸液100 μL涂布于含碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，每個梯度作三個平行。挑選革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌株，初步鑒定為乳酸菌。將其接種到斜面保存培養(yǎng)基，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 乳酸定性鑒定

通過紙層析乳酸定性試驗確定產(chǎn)乳酸細菌[9]。以1.5%乳酸為標準溶液，展開劑為正丁醇∶甲酸∶水=75∶15∶10，顯色劑為0.04%溴甲酚藍乙醇溶液，用0.1 mol/L NaOH標準溶液調(diào)pH至6.7，各菌株發(fā)酵液以毛細管點樣，進行層析。待層析液揮發(fā)之后，向?qū)游鰹V紙噴灑顯色劑并計算Rf值。

1.4.3 高產(chǎn)酸菌株篩選

將活化的菌株以3%（體積分數(shù)）的接種量接到MRS液體培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵酸度。取1 mL發(fā)酵液于150 mL三角瓶中，加入50 mL水，以酚酞為指示劑，用0.1 mol/L的NaOH標準溶液滴定至溶液微紅色，且30 s不褪色。記錄NaOH溶液的用量，同時做空白試驗。酸度（°T）以100 mL發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量計[10]。

式中：CNaOH指 NaOH標準溶液的摩爾濃度0.1 mol/L；V指滴定所用的NaOH標準溶液的體積，L。

1.4.4 耐酸菌株篩選[11]

用1 mol/L鹽酸溶液將MRS液體培養(yǎng)基pH分別調(diào)至為1.5、3.0，將篩選的菌株按照3%（體積分數(shù)）的接種量加到不同pH的培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)3 h，通過稀釋涂布平板法進行菌落計數(shù)，計算存活率。

1.4.5 耐膽鹽菌株篩選[12]

將篩選的菌株以3%（體積分數(shù)）的接種量分別接種于不同膽鹽濃度的液體MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)3 h，通過稀釋涂布平板法進行菌落計數(shù)，計算存活率。

1.4.6 菌株發(fā)酵南瓜汁性能試驗

南瓜汁的制備：南瓜→清洗、去皮、切塊→熱燙→榨汁、過濾→滅菌南瓜汁

將前期篩選得到的菌株接種于滅菌南瓜汁中，于37℃進行發(fā)酵。通過比較pH變化、菌株生長情況確定最終發(fā)酵菌株。

1.4.7 發(fā)酵菌株形態(tài)學及生理生化鑒定

參照文獻[8]中乳酸菌的鑒定方法，對各菌株進行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、H2S試驗、吲哚試驗以及各種糖利用試驗，初步確定菌株種類。

1.4.8 菌株的16SrDNA分子鑒定

將菌株送至北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司進行16SrDNA基因測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

根據(jù)培養(yǎng)基中鈣溶圈的大小，分離出13株菌，其中桿菌11株，球菌2株。又根據(jù)革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的結(jié)果初步篩選出桿菌7株，球菌2株。

2.2 乳酸紙層析結(jié)果

對菌株進行紙層析法檢測發(fā)酵液中是否含有乳酸，結(jié)果見表1。

表1 標準乳酸與各菌株發(fā)酵液紙層析的Rf值比較Table 1 Comparison of paper chromatography Rf values of standard lactic acid and fermentation liquid

由表1可知，各菌株發(fā)酵液與1.5%的標準乳酸溶液的Rf值相近，因此，可確定各菌株發(fā)酵液中含有乳酸。

2.3 產(chǎn)酸能力測定

通過對9株菌進行產(chǎn)酸能力測定，選擇產(chǎn)酸能力強的菌株，結(jié)果如圖1。

從圖1可以看出，九株菌均具有一定的產(chǎn)酸能力，其中 St1、St3、St5、St7、St8 五株菌在培養(yǎng) 12 h 時發(fā)酵酸度達 1×10－2°T 以上，24 h 時接近 2×10－2°T，產(chǎn)酸能力強，因此選擇這五株菌進行后續(xù)試驗。

圖1 各菌株的產(chǎn)酸量Fig.1 Acid production of different stains

2.4 耐酸能力試驗

益生菌必須進入人體腸道并保持一定的數(shù)量才能發(fā)揮其正常功能。在進入腸道的過程中，要通過胃，正常情況下，胃液的pH為3.0左右，在空腹或者食用酸性食品時可低至1.5，食物從攝入到通過胃大約3 h[13]。因此，配制pH1.5和pH3.0兩個梯度的MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3 h后通過梯度稀釋進行菌落計數(shù)。由表2可見，在pH3.0條件下，各菌株存活率均在95%以上，當pH降至1.5，菌株的存活率明顯降低，St7存活率降至37.5%，其余菌株存活率在50%以上，通過比較確定St1，St3，St5，St8對低pH具有較強的抵抗力。

表2 不同pH條件下菌株存活能力Table 2 Survival rate（%）of stains under acidic conditions

2.5 耐膽鹽能力試驗

正常人體小腸中膽鹽的濃度在0.03%～0.3%，益生菌要在腸道內(nèi)定植并發(fā)揮作用，必須耐受一定濃度的膽鹽[14]。因此，實驗選擇牛膽鹽濃度為0.1%和0.3%的MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3 h，觀察各菌株的耐受力。由表3可見，在膽鹽濃度0.1%的培養(yǎng)基中，五株菌的存活率都在90%以上，其中St5具有較強的存活能力，存活率為97.8%；在膽鹽濃度0.3%的培養(yǎng)基中，各菌株的存活率下降較大，除St7外，其余菌株存活率在 50%以上。因此，St1、St3、St5、St8四株菌具有較強的耐膽鹽能力。

2.6 南瓜汁發(fā)酵試驗

通過對菌株的產(chǎn)酸能力及耐酸、耐膽鹽能力進行比較，選擇St1、St3、St5、St8 4株菌進行南瓜汁發(fā)酵試驗，測定發(fā)酵過程中pH和菌株生長情況。

表3 不同膽鹽濃度條件下菌株存活能力Table 3 Survival rate（%）of stains under different concentrations of bile salt

2.6.1 各菌株發(fā)酵過程中pH變化

pH的變化是影響南瓜汁發(fā)酵品質(zhì)的重要因素，也反映了菌株的發(fā)酵能力。各菌株的發(fā)酵能力見圖2。

圖2 各菌株發(fā)酵南瓜汁pH的變化Fig.2 pH changes in pumpkin juice during fermentation with the four stains

由圖2可見，四株菌的發(fā)酵液中pH下降明顯，8 h時 pH已降到4以下，24 h時 St1、St3、St5、St8的 pH 分別為 3.59、3.47、3.37、3.43，可見四株菌均具有良好的發(fā)酵產(chǎn)酸能力。

2.6.2 各菌株在南瓜汁中的生長情況

各菌株在南瓜汁中的生長情況見圖3。

圖3 各菌株在南瓜汁中的生長情況Fig.3 The OD value of pumpkin juice during fermentation with the four stains

由圖3可見，四株乳酸菌都能很好的適應(yīng)南瓜汁的環(huán)境，經(jīng)過4 h進入對數(shù)期，生長態(tài)勢良好，24 h時左右進入穩(wěn)定期，此時，各菌株的OD600值分別為1.24、1.178、1.054、0.815。

通過以上的發(fā)酵試驗，St1、St3、St5、St8 這四株菌都顯示出良好的發(fā)酵性能，均可用于南瓜汁發(fā)酵。

2.7 菌株生理生化試驗結(jié)果

通過對菌株進行生理生化鑒定試驗，初步確定菌株種類，結(jié)果見表4。

表4 菌株生理生化實驗結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strains

對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]中乳酸菌的生理生化試驗及各種糖發(fā)酵試驗結(jié)果，初步判定菌株St1為干酪乳桿菌、St3、St5均為植物乳桿菌、St8有待進一步鑒定。

2.8 16SrDNA序列測定結(jié)果

通過北京三博遠志生物技術(shù)有限公司對篩選的菌株進行16SrDNA全序列測定，并將測定的序列從GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析，結(jié)果為St1為干酪乳桿菌、St3為植物乳桿菌、St5為植物乳桿菌植物亞種、St8為鼠李糖乳桿菌。

3 結(jié)果與討論

本實驗從不同品牌酸奶及泡菜濃漿中分離得到13株乳酸菌，通過對菌株產(chǎn)酸能力、耐酸、耐膽鹽能力進行比較，篩選出4株高產(chǎn)酸、耐受性良好的乳酸菌發(fā)酵南瓜汁，發(fā)酵后可以顯著地改善南瓜汁的口感，具有南瓜的香味和發(fā)酵特有的香氣，同時由于含有一定數(shù)量的乳酸菌，具有多重保健功能。因此，可以將這四株菌作為南瓜乳酸發(fā)酵專用菌株，進行發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)。根據(jù)菌株的生長特性和相互之間的影響，可以將菌株經(jīng)過比例復合進行混合菌株發(fā)酵，更好地提高發(fā)酵品質(zhì)。

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