文蛤坎氏弧菌的分離鑒定

王雪鵬 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271018）柴雪良 閆茂倉 （浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 溫州）

文蛤坎氏弧菌的分離鑒定

王雪鵬 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271018）柴雪良 閆茂倉*（浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 溫州）

本文從江蘇文蛤養(yǎng)殖區(qū)發(fā)病文蛤中分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，人工感染顯示菌株能引起供試文蛤發(fā)病，死亡率為68.75%，且發(fā)病癥狀與原發(fā)病癥狀相同，提示該菌是引起文蛤大面積死亡的主要致病菌。對(duì)其形態(tài)、生理生化特征致病性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示分離菌株為革蘭氏陰性菌，直桿狀，主要生理生化指標(biāo)賴氨酸脫羧酶、硝酸鹽還原、甘露糖、氧化酶為陽性，精氨酸脫羧酶、鳥氨酸酸脫羧酶、V.P為陰性。結(jié)合革蘭氏染色、形態(tài)、生理生化特點(diǎn)，最后鑒定該分離菌株為坎氏弧菌。

文蛤 坎氏弧菌 16S rRNA

文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)是我國沿海常見的一種重要經(jīng)濟(jì)貝類，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外消費(fèi)者歡迎，是出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)品之一。文蛤養(yǎng)殖在我國已有多年的歷史，隨著國際市場(chǎng)對(duì)文蛤需求量的不斷增長，我國的文蛤養(yǎng)殖業(yè)得到了迅速發(fā)展，但是近10幾年來，隨著文蛤養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境惡化導(dǎo)致微生物疾病的流行而引發(fā)的養(yǎng)殖文蛤的大規(guī)模死亡屢屢發(fā)生，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，全國養(yǎng)殖貝類因微生物疾病導(dǎo)致死亡而造成的經(jīng)濟(jì)損失保守估計(jì)每年達(dá)到20～30億元[1]。而弧菌(Vibrio)是導(dǎo)致文蛤發(fā)病的主要致病菌，發(fā)病的文蛤表現(xiàn)為不能潛入沙中，雙殼不能緊閉，殼邊緣有許多粘液，消化道內(nèi)細(xì)菌大量繁殖[2]，國內(nèi)外的報(bào)道有副溶血弧菌[3-6]和弗氏弧菌[7]，鄭國興等[8]發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致江蘇沿岸文蛤大規(guī)模死亡的病原菌為溶藻弧菌，而坎氏弧菌作為文蛤病原菌的研究還未見報(bào)道。本研究對(duì)發(fā)病文蛤優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分離、鑒定，并進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，探討分析導(dǎo)致文蛤大規(guī)模死亡的病原，旨在為文蛤疾病研究提供理論依據(jù)，為文蛤健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病文蛤癥狀 患病文蛤(殼長2cm左右)花色暗淡無光澤，表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發(fā)現(xiàn)外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分病蛤腮黏液明顯增多。

1.2 分離方法 無菌鹽水洗凈，用70%的酒精棉球?qū)w表擦拭消毒，無菌手術(shù)刀開啟，取肝胰臟等部位無菌勻漿器中勻漿處理，zobell 2216E平板和TCBS平板劃線接種，28℃培養(yǎng)24h后，選取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行重復(fù)劃線純化，純培養(yǎng)物于4℃冰箱中保存。

1.3 人工感染試驗(yàn) 人工感染試驗(yàn)在20L水族箱中進(jìn)行，溫度28℃，鹽度26.4，pH8.2，連續(xù)充氣，每組放16只2cm大小的文蛤。換水1次/d，試驗(yàn)組調(diào)節(jié)水體中細(xì)菌濃度為108cfu/ml，投單胞藻1次/d；對(duì)照組不加入菌體，按上述方法飼養(yǎng)；連續(xù)觀察12d，紀(jì)錄死亡狀況，并進(jìn)行解剖和病原的再分離以確定是否死于攻毒活菌引起的感染。

1.4 細(xì)菌鑒定 按一般細(xì)菌常用鑒定方法[10]進(jìn)行分離菌的生物學(xué)性狀測(cè)定，包括革蘭氏染色、形態(tài)觀察、生理生化特性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離及其形態(tài)特征 經(jīng)分離純化后，從病蛤中分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，分離的菌株為革蘭氏陰性直桿菌，菌體直或稍彎，無莢膜，靠鞭毛運(yùn)動(dòng)。在TCBS(硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽)瓊脂平板上培養(yǎng)菌落成綠色，菌落直徑為3～7mm。

2.2 人工感染試驗(yàn) 表1顯示，該分離菌感染文蛤8d后開始死亡，12d的病死率為68.75%。于是初步判定該養(yǎng)殖場(chǎng)文蛤大批死亡是以該分離菌為主要病原體的傳染病所致。

表1 人工感染死亡時(shí)間和死亡數(shù)量 (%)

2.3 分離菌株生化特性 該分離菌株無鹽不生長，在含8%以上NaCl胨水中不生長，主要生化結(jié)果見表2。根據(jù)表2生化結(jié)果判定該菌為坎氏弧菌。

表3 分離菌株的生理生化特性

3 討論

（1）本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的生理生化分析技術(shù)，對(duì)從患病文蛤中分離的菌株進(jìn)行了綜合鑒定。通過生理生化實(shí)驗(yàn)可知，該分離菌株與坎氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株[11]基本相同，初步鑒定該分離菌株為坎氏弧菌。（2）坎氏弧菌是海洋環(huán)境中的常見菌，廣泛分布于沿海水域，河口及水產(chǎn)品中。在人源致病性弧菌的診斷中也常檢測(cè)到，如周明島等[9]在調(diào)查海口市致病性弧菌分布時(shí)，從腹瀉病人糞便中檢出弧菌221株，其中有25株為坎氏弧菌，占11.3%，僅次于副溶血性弧菌。陳梅等[10]對(duì)山東近海主要養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌種類與分布的調(diào)查中，在鱸魚和黑鯛體內(nèi)檢出多株坎氏弧菌。王祥紅等[11]在研究中國對(duì)蝦腸道微生物區(qū)系時(shí)發(fā)現(xiàn)中國對(duì)蝦腸道弧菌屬中坎氏弧菌占20%。沈曉盛從福建沿岸養(yǎng)殖太平洋牡蠣體內(nèi)分離到4株坎氏弧菌，進(jìn)一步說明坎氏弧菌在海洋水域及海水養(yǎng)殖貝類動(dòng)物中也廣泛分布[12]。（3）坎氏弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的條件致病弧菌之一，許兵等[13]報(bào)道了坎氏弧菌可引起養(yǎng)殖中國對(duì)蝦紅腿病，病菌可侵入循環(huán)系統(tǒng)導(dǎo)致敗血癥，是養(yǎng)殖對(duì)蝦的一種常見病，危害較為嚴(yán)重。馬鍵民等[14]報(bào)道坎氏弧菌是皺紋盤鮑膿毒敗血癥病原菌，病鮑腹足肌肉上可見大小不等的膿瘡，血淋巴液和膿汁中充滿大量桿菌，死亡率極高，是北方沿海養(yǎng)鮑業(yè)最主要的流行病。作者從江蘇文蛤體內(nèi)檢出1株坎氏弧菌，國內(nèi)也未見坎氏弧菌引起文蛤患病的報(bào)導(dǎo)。一般認(rèn)為，弧菌是一種條件致病菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)外和養(yǎng)殖環(huán)境中的正常菌群，當(dāng)環(huán)境條件異常，導(dǎo)致弧菌大量繁殖時(shí)或養(yǎng)殖動(dòng)物因種種原因，體質(zhì)下降時(shí)，往往會(huì)引起弧菌病的暴發(fā)流行。作者從文蛤中分離到的1株坎氏弧菌，說明該菌對(duì)文蛤養(yǎng)殖業(yè)具有潛在的危險(xiǎn)，應(yīng)引起足夠重視。

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S852.61+3

A

1007-1733(2014)06-0022-02

2014–02–24）

浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(J2013006)；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012C22072，2012F20029)；浙江省自然科學(xué)基金(Y14C190013).

*通訊作者