大鼠脊髓損傷后勿動(dòng)蛋白受體的動(dòng)態(tài)表達(dá)

楊俊鋒，張亞峰，馬勇，吳毛，郭楊，顧曉林，王建偉

·基礎(chǔ)研究·

大鼠脊髓損傷后勿動(dòng)蛋白受體的動(dòng)態(tài)表達(dá)

楊俊鋒1，張亞峰1，馬勇2，吳毛1，郭楊2，顧曉林2，王建偉1

目的觀察大鼠脊髓損傷后勿動(dòng)蛋白受體(NgR)在脊髓組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。方法108只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組和模型組，每組36只，其中模型組采用改良Allen法造模。3組分別于干預(yù)后24 h、3 d、7 d、14 d處死大鼠，每組9只，以免疫組化及Western blotting檢測各組大鼠脊髓組織中NgR表達(dá)的變化，以熒光定量PCR檢測NgR mRNA表達(dá)變化。結(jié)果正常組、假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)NgR表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)。模型組在損傷后24 h NgR及其mRNA表達(dá)較低，3 d后下降至最低，7 d后迅速上升達(dá)到高峰，14 d時(shí)有所下降。與正常組比較，模型組在損傷后各時(shí)間點(diǎn)，NgR免疫組化及Western blotting蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組在損傷后各時(shí)間點(diǎn)，NgR mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論大鼠脊髓損傷后，NgR及其mRNA表達(dá)均在7 d時(shí)上升至峰值，并較長時(shí)間保持高水平表達(dá)。這可能是造成脊髓損傷后軸突再生困難的重要原因之一。

脊髓損傷；勿動(dòng)蛋白受體；軸突再生；大鼠

[本文著錄格式]楊俊鋒，張亞峰，馬勇，等.大鼠脊髓損傷后勿動(dòng)蛋白受體的動(dòng)態(tài)表達(dá)[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20 (10):919-923.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后如何促進(jìn)軸突再生一直是脊髓損傷修復(fù)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，大多數(shù)國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為脊髓損傷后髓磷脂相關(guān)抑制蛋白的抑制作用是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)軸突再生的關(guān)鍵因素之一[1-2]。勿動(dòng)蛋白受體(Nogo receptor,NgR)是CNS髓磷脂相關(guān)蛋白Nogo-A、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein, MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp)共同作用的靶點(diǎn)[3]。明確NgR在脊髓組織中的表達(dá)規(guī)律，并針對性地阻斷NgR的抑制作用已成為近年來研究的熱點(diǎn)[4-6]。

本研究旨在觀察大鼠脊髓組織NgR及其基因表達(dá)，進(jìn)一步探討NgR在神經(jīng)再生過程中的意義和作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

108只清潔級Sprague-Dawley大鼠，雌性，體質(zhì)量180～220 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按5只/籠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心恒溫恒濕動(dòng)物房，自由進(jìn)食、飲水。

采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和模型組，每組各36只。正常組不做任何處理；假手術(shù)組咬除T9～T11棘突及椎板，避免損傷脊髓；模型組按照改良Allen法造模。

1.2 模型制備

10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉，將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。以T10棘突為中心取背部后正中縱行切口，長約3 cm，逐層進(jìn)入，沿棘突剝離椎旁肌，顯露T9～T11棘突及椎板，仔細(xì)咬除T9～T11全部椎板至椎弓根部，暴露硬脊膜并保持其完整性。采用改良Allen法[7]制備動(dòng)物模型：25 g?cm(10 g×2.5 cm)垂直打擊大鼠T9～T11節(jié)段脊髓，可見大鼠后肢痙攣性抽搐數(shù)次后軟癱，逐層縫合至皮膚。術(shù)后每天予以青霉素8×104U腹腔注射預(yù)防感染，保持會(huì)陰部干燥，每天兩次擠壓膀胱協(xié)助排尿。

1.3 標(biāo)本采集

按照實(shí)驗(yàn)分組，每組分別于干預(yù)后24 h、3 d、7 d、14 d各取9只，隨機(jī)取3只用于免疫組化檢測，3只用于PCR檢測，3只用于Western blotting檢測。

10%水合氯醛0.3～0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管，用生理鹽水100 ml灌注后，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)的大鼠以4%多聚甲醛PBS溶液500 ml灌注固定2 h，以造模損傷區(qū)為中心，取出長約1 cm的脊髓組織，投入4%多聚甲醛液內(nèi)繼續(xù)固定24 h，然后以2 ml凍存管4℃冰箱保存。用于PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)的大鼠以PBS溶液500 ml灌注固定2 h，以造模損傷區(qū)為中心，取出長約1 cm的脊髓組織放于2 ml凍存管液氮中，-70℃冰箱保存。

1.4 免疫組化法檢測脊髓組織NgR蛋白表達(dá)

所取標(biāo)本依次經(jīng)梯度乙醇組織脫水、二甲苯透明后，行石蠟包埋，以脊髓直接損傷處為中心冠狀位連續(xù)行厚約4～5 μm的超薄切片，每個(gè)樣本切片10張，隨機(jī)取石蠟切片5張按Envision試劑盒行免疫組織化學(xué)分析。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，以胞漿內(nèi)淡黃色或棕黃色顆粒染色為陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(200×)，各組所選部位相同，以Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度值(mean density, MD)，以5個(gè)視野平均光密度的平均值作為該張切片的測量值。

1.5 Western blotting檢測脊髓組織NgR蛋白表達(dá)

取各組脊髓組織40 mg，在冰浴下依次加入細(xì)胞裂解液200 μl，研磨勻漿，15000 r/min離心，提取上清總蛋白，按BCA法蛋白定量，生理鹽水調(diào)平，加入2×上樣緩沖液后98℃下加熱變性5 min，冷卻后-70℃冰箱保存。β-actin、NgR均采用5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，Trans-blot?SD蛋白半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印蛋白。然后，脫脂奶粉室溫封閉2 h后以1×TBST洗膜3次，每次5 min，一抗(β-actin，1∶1000，美國CST；NgR，1∶1000，美國Abcam)4℃下孵育過夜。再次以1×TBST洗膜3次，每次5 min，二抗(美國Bioworld)室溫孵育2 h(1∶5000)后再次以1×TBST洗膜3次，每次5 min，ECL法顯色，Image Quant LAS 4000mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀成像。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)，采用NgR條帶灰度值/β-actin條帶灰度值的比值表示NgR的相對表達(dá)量。

1.6 熒光定量PCR法檢測脊髓組織NgR mRNA表達(dá)

-70℃分別取出各組脊髓組織，每50～100 mg組織加入Trizol裂解液1 ml，球磨儀研磨勻漿，Trizol法提取總mRNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。以逆轉(zhuǎn)錄(RT法)合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

參照GenBank公布的NgR和GAPDH cDNA序列，設(shè)計(jì)NgR上游引物5'-TGACTTAGAGGGTTGTGCTGTG-3'，下游引物5'-CATTGCCTGGTGGAGTGTC-3'(擴(kuò)增產(chǎn)物206 bp)；GAPDH上游引物5'-CTGAGCACTCTCCCTCACAATTC-3'，下游引物5'-GTGCAGCGAACTTTATTGATGGT-3'(擴(kuò)增產(chǎn)物102 bp)。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成目的基因NgR和GAPDH的引物。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，上述變性、退火步驟循環(huán)40次。隨后繼續(xù)進(jìn)行建立熔解曲線的反應(yīng)：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。以管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法分析NgR基因在脊髓組織中的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，正態(tài)分布定量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)法兩兩比較，不滿足方差分析條件時(shí)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 脊髓組織NgR免疫組化動(dòng)態(tài)表達(dá)

正常組、假手術(shù)組脊髓組織中NgR在24 h、3 d、7 d、14 d各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)相對穩(wěn)定，且兩組間表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。模型組NgR表達(dá)在24 h下降，3 d時(shí)達(dá)到低谷，7 d時(shí)顯著增高至峰值，14 d時(shí)有所下降，但仍高于正常組表達(dá)量，其中24 h、3 d、7 d、14 d時(shí)模型組與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1和圖1。

2.2 脊髓組織NgR Western blotting動(dòng)態(tài)表達(dá)

Western blotting分析顯示，正常組和假手術(shù)組在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)NgR表達(dá)較為恒定，兩組各時(shí)間點(diǎn)比較，無顯著性差異(P＞0.05)。假手術(shù)組與正常組于同一時(shí)間點(diǎn)比較，無顯著性差異(P＞0.05)。模型組在脊髓損傷后24 h NgR表達(dá)下降，至3 d時(shí)表達(dá)水平最低，于7 d時(shí)上升至峰值，之后有下降的趨勢，且與正常組比較，各時(shí)間點(diǎn)NgR蛋白表達(dá)量均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。見圖2和表2。

表1 各組大鼠脊髓組織中NgR表達(dá)(MD)

表2 各組大鼠NgR蛋白表達(dá)相對水平

2.3 脊髓組織NgR mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)

假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)NgR mRNA表達(dá)量穩(wěn)定，在各時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異(P＞0.05)。模型組在24 h NgR mRNA表達(dá)下降，3 d后下降至最低，7 d后迅速上升至峰值，至14 d下降，但仍高于假手術(shù)組，各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較，有非常顯著性差異(P＜0.01)。見表3。

表3 各組大鼠NgR mRNA在脊髓組織中的動(dòng)態(tài)變化(n=3)

3 討論

NgR作為Nogo、MAG和OMgp的共同受體，介導(dǎo)三者軸突再生的抑制作用[8]。NgR家族包括NgR1、NgR2、NgR3等，其中NgR1為通常所說NgR，共含有473個(gè)氨基酸，其信號(hào)肽段位于N端，中間段由兩組富亮氨酸重復(fù)序列組成(其中一組含有8個(gè)氨基酸，另一組富含半胱氨酸)，此區(qū)域?yàn)镹ogo-66結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn)，C端則通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)結(jié)構(gòu)錨定在細(xì)胞膜上[9]。NgR因?yàn)槿狈?xì)胞內(nèi)組分而不能介導(dǎo)跨膜和/或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程，故NgR和p75NTR、LINGO-1組成復(fù)合體，與配體結(jié)合后，通過第二信使cAMP、Ca2+啟動(dòng)下游Rho/ROCK信號(hào)通路，引起生長錐局部肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改變，導(dǎo)致絲狀偽足和薄片狀偽足收縮，從而改變生長錐的形態(tài)和穩(wěn)定性，最終造成生長錐萎縮[10]。因此，NgR作為髓磷脂相關(guān)抑制蛋白的重要靶點(diǎn)，抑制其表達(dá)可有效改善CNS微環(huán)境，是目前脊髓損傷修復(fù)研究的熱點(diǎn)[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)采用改良Allen法成功復(fù)制大鼠脊髓挫裂傷模型。通過觀察大鼠脊髓損傷組織內(nèi)NgR及基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)NgR表達(dá)的一般動(dòng)態(tài)規(guī)律。在脊髓損傷24 h時(shí)，NgR及其mRNA均呈低水平表達(dá)?？紤]主要原因可能是脊髓損傷早期原發(fā)性損傷啟動(dòng)的一系列細(xì)胞和分子水平的生化級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致組織缺血、水腫、細(xì)胞凋亡、微循環(huán)障礙、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、軸突脫髓鞘等，組織蛋白呈低水平表達(dá)所致。

圖1 各組大鼠脊髓組織NgR動(dòng)態(tài)表達(dá)(免疫組化，200×)

圖2 各組大鼠NgR在脊髓組織中的表達(dá)

當(dāng)脊髓損傷至3 d時(shí)，NgR表達(dá)下降至最低，7 d后迅速上升至峰值，14 d時(shí)雖然逐漸下降，但仍較長時(shí)間維持高水平表達(dá)。

目前國內(nèi)外針對髓磷脂相關(guān)抑制因子的抑制作用進(jìn)行了一系列研究和實(shí)驗(yàn)，主要有Nogo-A單克隆抗體LN-1、NgR拮抗劑NEP 1-40、單克隆抗NgR抗體、LINGO-FC、基因敲除技術(shù)、巨噬細(xì)胞干預(yù)以及提高細(xì)胞內(nèi)cAMP或Ca2+等[14-15]。雖然在一定程度上可促進(jìn)軸突再生，但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脊髓損傷仍不能完全修復(fù)，神經(jīng)功能恢復(fù)仍不理想。

本研究明確了NgR表達(dá)的一般動(dòng)態(tài)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后7 d是個(gè)重要的時(shí)間點(diǎn)。我們可以在今后的實(shí)驗(yàn)研究中，在選擇特異性阻斷NgR表達(dá)的方法時(shí)，注重脊髓損傷后1周左右的治療重要窗口期，并為了保證治療效果，適當(dāng)延長治療周期。當(dāng)然，由于動(dòng)物模型、造模方式以其觀察周期不同，NgR表達(dá)的變化規(guī)律以及NgR高峰表達(dá)時(shí)機(jī)、維持周期均有可能出現(xiàn)一定出入[16]，應(yīng)相應(yīng)靈活調(diào)整，以利于提高脊髓損傷修復(fù)療效。

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Dynamic Expression of Nogo Receptor after Spinal Cord Injury in Rats

YANG Jun-feng,ZHANG Ya-feng,MA Yong,WU Mao,GUO Yang,GU Xiao-lin,WANG Jian-wei.Wuxi Hospital of Chinese Medicine,Institute of Orthopaedics and Traumatology of Nanjing University of Chinese Medicine,Wuxi,Jiangsu 214000,China

ObjectiveTo observe the dynamic expression of Nogo receptor(NgR)in spinal cord of rats after spinal cord injury.Methods108 Sprague-Dawley rats were randomly assigned into normal group,sham operated group and model group,with 36 rats in each group. The model of spinal cord injury was established with the modified Allen's method.The rats were killed 24 h,3 days,7 days and 14 days respectively after intervention(9 rats from each group),and expression of NgR in the spinal cord tissue of the rats was detected with immunohistochemistry and Western blotting,and expression of NgR mRNA was detected with fluorescence quantitative PCR.ResultsThere was no significant change in the expression of NgR in the normal group and the sham operated group(P＞0.05).The expression of protein and mRNA of NgR was less in the model group 24 h after modeling,dropped to the lowest on the 3rd day,then rapidly peaked on the 7th day, and gradually declined on the 14th day after spinal cord injury.Compared with the normal group,there were significant differences in expression of NgR in immunohistochemistry and Western blotting in the model group at each time point after spinal cord injury(P＜0.05). Compared with the sham operated group,there were significant differences in expression of NgR mRNA in the model group at each time point after spinal cord injury(P＜0.01).ConclusionThe expression of NgR and mRNA peaks on the 7th day after spinal cord injury in the rats,and maintains at high level for a long time,which may associated with the difficulty of axonal regeneration after spinal cord injury.

spinal cord injury;Nogo receptor;axonal regeneration;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.10.006

R651.2

A

1006-9771(2014)10-0919-05

2014-03-06

2014-04-16)

1.江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.BK2011180)；2.江蘇省2013年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No.CXZZ13-0614)；3.江蘇省2012年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No.CXZZ12-0609)。

1.無錫市中醫(yī)醫(yī)院，南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，江蘇無錫市214000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京市210023。作者簡介:楊俊鋒(1979-)，男，漢族，江蘇宜興市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：脊柱脊髓損傷。通訊作者：王建偉(1963-)，男，漢族，江蘇無錫市人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：脊柱脊髓損傷、脊髓腫瘤、脊柱側(cè)彎。E-mail:905966615@qq.com。

時(shí)間：2014-06-30 15:56

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3759.R.20140808.0915.003.html