大鼠脊髓損傷后P物質與神經源性腸道功能障礙的關系

龍志華，高飛，張鋒良，岳軍忠，王磊，王燁，劉文國，徐青

大鼠脊髓損傷后P物質與神經源性腸道功能障礙的關系

龍志華，高飛，張鋒良，岳軍忠，王磊，王燁，劉文國，徐青

目的探討脊髓損傷后結腸中P物質與神經源性腸道功能障礙的關系。方法60只體質量(220±40)g的雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組(n=20)、正常對照組(n=20)和模型組(n=20)。氯胺酮60 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，利用NYU脊髓打擊器，以75 g?cm致傷力制作T10脊髓損傷模型，分別于造模后24 h、1周、3周和5周時切除大鼠結腸組織制作標本，檢測腸道傳輸功能，采用ELISA方法測定血清中和組織中的P物質含量，實時熒光定量PCR和Western blotting法檢測P物質mRNA和蛋白表達。結果模型組大鼠脊髓損傷后出現(xiàn)腸道傳輸功能下降，且于造模后3周時腸道傳輸達到最低值；造模后3周時模型組血清和組織中P物質含量與假手術組相比均降低，結腸組織中P物質的mRNA及蛋白表達水平也下調，與假手術組、正常對照組相比具有顯著性差異，假手術組P物質的表達是模型組的(3.12±0.51)倍(P＜0.05)。結論大鼠脊髓損傷后神經源性腸道功能障礙與結腸中P物質的表達降低有關。

脊髓損傷；P物質；神經源性腸道功能障礙；大鼠

[本文著錄格式]龍志華，高飛，張鋒良，等.大鼠脊髓損傷后P物質與神經源性腸道功能障礙的關系[J].中國康復理論與實踐,2014,20(8):718-722.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)不僅嚴重地損害患者的軀體感覺和運動功能，且對胃腸神經系統(tǒng)造成影響使得胃腸運動、肛門括約肌功能及肛門反射、排便協(xié)調性等發(fā)生改變，導致患者發(fā)生神經源性腸道功能障礙(neurogenic bowel dysfunction,NBD)[1]。調查發(fā)現(xiàn)，41%的脊髓損傷患者認為NBD嚴重影響生活質量。在脊髓損傷患者中高達1/3出現(xiàn)NBD，主要表現(xiàn)為便秘、腹脹以及大便失禁等[2-4]。

隨著對腸神經系統(tǒng)研究的深入，對慢性傳輸型便秘發(fā)病機理有了進一步認識。但脊髓損傷后腸神經系統(tǒng)和胃腸激素的作用機理及改變的相關研究嚴重滯后。本文擬對大鼠脊髓損傷后出現(xiàn)的NBD與胃腸激素中P物質之間的關系進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與分組60只健康雄性Sprague-Dawley大鼠(編號：RD008)，體質量(220±40)g，SPF級，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證編號：SCK-(軍)2009-005。

飼養(yǎng)條件：室溫16～25℃，相對濕度50%～70%，分籠飼養(yǎng)，飼以普通飼料，環(huán)境清潔安靜。

采用抽簽法隨機分為假手術組(n=20)、正常對照組(n=20)和模型組(n=20)，每組又分為造模后24 h、1周、3周和5周共4個時間點，每個時間點5只大鼠。各組間大鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。飼養(yǎng)1周后開始建立脊髓損傷模型。

1.1.2 主要試劑粉末活性炭(分析純)(臺山市聯(lián)興化工有限公司)；BCA Protein Assay Kit(PIERCE公司，美國)；SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司，美國)；大鼠P物質酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢伊艾博科技有限公司)；抗P物質抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、化學發(fā)光試劑盒(SANTA CRUZ公司，美國)；辣根過氧化物酶標記的抗GAPDH抗體(中國康成公司)；M-MLV逆轉錄試劑盒(INVITROGEN公司，美國)；RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，德國)。

1.1.3 動物模型制備氯胺酮60 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，利用NYU脊髓打擊器(美國，紐約大學)以75 g?cm致傷力制作T10脊髓損傷模型[5]。

脊髓損傷模型成功的標志為，在打擊器撞擊脊髓的瞬間，動物身體抖動，雙下肢迅速回縮并出現(xiàn)彈動動作，尾巴翹起并迅速倒下，打擊局部脊髓表面迅速呈瘀紫色，術后雙下肢出現(xiàn)完全癱瘓。

取每個試件中通過位移傳感器測量的工字鋼豎向相對位移的平均值為橫坐標，取加載試驗機的荷載值為縱坐標.試驗以單調靜力加載方式對試件進行加載，以200 kN為單位進行測量讀數(shù)，讀取試件的豎向位移.最后得到試件的荷載位移曲線.

假手術組大鼠同法暴露T10段脊髓，但不造成脊髓打擊傷。

正常對照組大鼠不做任何處理。

1.1.4 取材手術后大鼠用普通飼料飼養(yǎng)，各時間點大鼠禁食24 h后，暴露腹腔，下腔靜脈采血置于含抑肽酶40μl的清潔試管中，室溫下血液自然凝固2 h，1000 g離心20min，取上清置于-80℃冰箱保存待測。

經口灌入活性炭懸液10 ml/kg(懸液濃度100 g/ L)，30min后氯胺酮60 mg/kg腹腔注射麻醉，立即剖腹取出幽門至直腸末端的全部腸管并測量。迅速切取結腸中段腸管，用生理鹽水沖去腸內容物以及黏膜表面粘附的糞便、分泌物和血液后，將結腸壁組織切成1.5×1.5×1.5 mm的小塊迅速置于-80℃冰箱內保存，用于提取結腸組織總RNA和總蛋白。

1.2 測定方法

1.2.1 腸道傳輸功能測定采用活性炭懸液推進法，在無張力狀況下用直尺測量腸道全長及活性炭混懸液在腸道內推進長度，并計算活性炭懸液推進長度占腸道全長的百分比(黑染腸管長度/腸道總長度×100%)，最后計算每組的平均值[6-7]。

1.2.2 P物質測定結腸組織用預冷生理鹽水洗去血液，濾紙吸干，按1∶9(結腸組織∶生理鹽水)加入生理鹽水制備組織勻漿，1000 g離心20min，取上清待測。

將制備好的血清樣品和組織上清應用大鼠P物質酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，按說明書測定血清中及組織上清中P物質含量。利用全自動酶標儀，在450nm處測定各孔的平均光密度值(mean density,MD)，采用Curve2Expert 113進行標準曲線的繪制，并計算出對應的濃度值。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)①組織總RNA的提?。喊凑誕IAGEN?RNeasy Mini Kit說明書的操作方法提取結腸組織總RNA，并用紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度。

②反轉錄方法制備cDNA：將稀釋后的總RNA 2 μg、Oligo(dT)15 0.5 μl、10 mmol/L dNTP 1 μl、超純水6.5 μl，依次加入PCR反應管中，65℃反應5min，立即轉入冰浴中，短暫離心后，加入5×第一鏈緩沖液4 μl，0.l mmol/L二硫蘇糖醇2 μl、M-MLV 200 U(1 μl)、超純水1 μl，輕輕混勻，短暫離心，37℃，50min；70℃，l5min終止反應，冰浴冷卻，并以不加逆轉錄酶的反應體系作為陰性對照。

③繪制引物標準曲線：根據(jù)P物質的cDNA序列，通過Primer Express 3.0軟件設計引物。以某一個樣本的4個不同量的cDNA為模板(100 ng、50 ng、25 ng、10 ng)做實時熒光定量聚合酶鏈反應(ABI 7300)，反應條件：95℃，10min；95℃，15 s；60℃，1min，共50個循環(huán)。將所獲得的PCR產物進行熔解曲線分析。將每個反應的Ct值與其cDNA加入量(ng)的lg值進行線性相關分析，計算其斜率。當斜率在-3.6～-3.0范圍內時，認為該反應的Ct值與相對應的模板量呈對應關系。故選取斜率位于-3.6～-3.0的引物序列待用。

④樣本測定：使用選定的引物對樣本進行PCR反應，將檢測的臨界點設定在PCR擴增過程中，熒光信號由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)數(shù)(Ct)作為模板初始濃度的間接指標，熔解曲線分析采用默認條件。結果用18S RNA進行校正。用ΔCt法計算相對基因表達，確定P物質mRNA的相對濃度。在實時定量分析中所得的熒光值可以反映目的產物的含量，各組所測得P物質的Ct值與18S RNA的Ct值的差值為ΔCt。各實驗組的ΔCt與正常對照組ΔCt值的差值為ΔΔCt。

1.2.4 Western blotting檢測在4℃條件下，加入裂解液提取結腸組織中的蛋白，用BCA Protein Assay Kit測定樣品蛋白含量。每個樣本取蛋白50 μg進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉4 h，加入1∶500 P物質兔多克隆抗體于4℃孵育過夜，TBST漂洗2次，每次5min，加入1∶10000辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次5min，將膜用化學發(fā)光試劑孵育1min，于X線片上曝光，常規(guī)顯影、定影。洗膜后孵育GAPDH單克隆抗體作為內參，將結果用Genetools軟件(PerklmElmer)進行密度分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 腸道傳輸功能測定

造模后1周，模型組有1只因術后感染死亡，其余4只動物與假手術組結腸長度無顯著性差異(P＞0.05)，正常對照組與假手術組結腸長度也無顯著性差異(P＞0.05)；造模后24 h、3周和5周，模型組與假手術組結腸長度均無顯著性差異，正常對照組與假手術組結腸長度也均無顯著性差異(P＞0.05)。

腸道傳輸功能測定發(fā)現(xiàn)，模型組造模后3周腸道傳輸功能達到最低值，造模后5周腸道傳輸功能開始升高，且造模后3周和5周模型組與假手術組相比降低(P＜0.05)，正常對照組與假手術組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。因此，造模后3周出現(xiàn)NBD的脊髓損傷動物模型造成結腸腸道傳輸功能減慢。

表1 結腸傳輸功能比較

2.2 血清和結腸組織中P物質變化

模型組大鼠脊髓損傷后24 h和1周，血清中P物質含量降低，傷后3周達最低值，傷后5周上升。見圖1。傷后3周，模型組血清中P物質含量與假手術組和正常對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。見圖2。傷后5周，模型組血清中P物質含量與假手術組和正常對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。傷后3周，模型組結腸組織中P物質含量與假手術組比較降低(P＜0.05)，正常對照組與假手術組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見圖3。

圖1 不同時間點血清中P物質含量變化

圖2 傷后3周血清中P物質的含量

圖3 傷后3周結腸組織中P物質的含量

2.3 結腸組織中P物質mRNA表達水平變化

選用表2所示的P物質引物序列測定大鼠結腸組織中P物質在mRNA水平的表達情況。取大鼠脊髓損傷造模后3周的組織提取總RNA，測定mRNA表達水平，結果顯示，大鼠在脊髓損傷造模后3周，假手術組P物質的表達是模型組的(4.52±0.35)倍(P＜0.05)，而假手術組與正常對照組相比無顯著性差異(P＞0.05))。見圖4。

表2 P物質引物序列

圖4 P物質基因mRNA在各組結腸組織中的表達

2.4 結腸組織中P物質蛋白表達水平變化

取大鼠脊髓損傷造模后3周的組織提取總蛋白進行Western blotting測定。結果顯示，大鼠在脊髓損傷造模后3周，假手術組P物質的表達是模型組的(3.12± 0.51)倍(P＜0.05)，而假手術組與正常對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見圖5。

圖5 P物質蛋白在各組大鼠結腸中的表達

3 討論

結腸運動受神經和胃腸激素的支配與調節(jié)。胃腸肽類激素是由胃腸道管壁上散在的內分泌細胞和胰腺的胰島分泌的高效能生物活性物質，它們與神經系統(tǒng)一起，調節(jié)消化器官的運動、分泌和吸收等功能[8]。這些胃腸激素通過旁分泌、自分泌、神經分泌等方式，介導細胞間信息傳遞，使其產生興奮和/或抑制作用。興奮性胃腸肽激素包括胃動素、胃泌素、內皮素、P物質等，抑制性胃腸肽激素包括血管活性肽、膽囊收縮素、胰泌素等。

P物質能神經元是腸道內一種重要的肽能神經元，對胃腸的運動功能起著重要的調節(jié)作用。P物質能神經元胞體存在于腸肌間神經叢內，發(fā)出的纖維分布至腸壁各層，是促進胃腸運動的神經遞質，對消化道平滑肌有強烈刺激作用，直接作用于全結腸腸壁肌，同時激活結腸中遠端膽堿能興奮通路和結腸近端非膽堿能興奮通路，并激活NO依賴的抑制性神經通路，從而增加胃腸蠕動[9-12]。

腸道問題是脊髓損傷患者主要的生理和心理問題，腸道問題給患者帶來的痛苦并不亞于失去運動能力的痛苦[13]。由于脊髓損傷后腸道的運動能力、括約肌的控制能力等問題使得脊髓損傷患者生活能力出現(xiàn)較大的障礙，這對患者的生活質量也產生巨大影響。目前有關脊髓損傷后結腸P物質能神經元及P物質含量的相關研究鮮見報道。本研究旨在探討是否脊髓損傷大鼠出現(xiàn)NBD與結腸中P物質含量的改變有關，為今后研究和治療脊髓損傷患者NBD提供可靠的理論依據(jù)。

成功建立大鼠脊髓損傷模型后，大鼠出現(xiàn)不同程度的便秘及腹脹，為實驗奠定良好基礎[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷造模后3周大鼠結腸傳輸功能減慢達到最低值，在造模后5周時發(fā)現(xiàn)結腸傳輸略有增加，在造模后3周和5周時模型組與假手術組比較結腸傳輸功能均降低(P＜0.05)，提示大鼠結腸在造模后3周開始出現(xiàn)結腸運動功能障礙。因此在后續(xù)的實驗中我們選擇脊髓損傷后3周的大鼠進行實驗。

研究還發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后導致NBD大鼠的血清和結腸組織中P物質與假手術組比較，表達降低(P＜0.05)。之后通過PCR和Western blotting方法檢測脊髓損傷后大鼠結腸組織中P物質的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，結腸組織中P物質的mRNA和蛋白表達與假手術組相比均下調(P＜0.05)。

由此可見，脊髓損傷后大鼠出現(xiàn)結腸功能障礙可能與大鼠結腸中P物質的減少和P物質能神經元病變有關。

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Substance P in Neurogenic Bowel Dysfunction after Spinal Cord Injury in Rats

LONG Zhi-hua,GAO Fei,ZHANG Feng-liang,YUE Jun-zhong,WANG Lei,WANG Ye,LIU Wen-guo,XU Qing.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Department of General Surgery,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Reserch Center,Beijing 100068,China

ObjectiveTo investigate the relationship between neurogenic bowel dysfunction(NBD)and substance P in rats suffering from spinal cord injury(SCI).Methods60 male Sprague-Dawley rats,weighted(220±40)g,were randomly divided into three groups:sham group(n=20),normal group(n=20)and model group(n=20)and then were subdivided into subgroups of 24 h,1 week,3 weeks,and 5 weeks respectively after SCI.SCI model was established at thoracic 10 segment of rat with NYU impactor device.The colon tissue of the rats was resected and stored.Substance P in serum and tissue was measured by ELISA.The tissue was examined by real-time RT-PCR and Western blotting to analyze the expression of substance P.ResultsThe colon intestinal transmission function decreased and delineated atminimum value at 3 weeks in the model group.There was statistical significance with respect to the content of substance P in serum and tissue between the sham group and model group at 3 weeks.The expression of substance P in the sham group was(3.12±0.51)times of the model group(P＜0.05).ConclusionSubstance P may take part in NBD after SCI in rats.

spinal cord injury;substance P;neurogenic bowel dysfunction;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.08.004

R651.2

A

1006-9771(2014)08-0718-05

2014-03-26

2014-04-11)

中國康復研究中心青年基金項目(No.2009-Q4)。

1.首都醫(yī)科大學康復醫(yī)學院，北京市100068；2.中國康復研究中心北京博愛醫(yī)院，北京市100068。作者簡介：龍志華(1976-)，男，漢族，湖南安仁縣人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要研究方向：胃腸外科。通訊作者：徐青，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師。E-mail:tsingcrrc@sina.cn。

時間：2014-06-30 15:57

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3759.R.20140808.0913.001.html